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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-177723
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.17772
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 29 November 2010 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Arndt Hartmann und PD Dr. Maximilian Burger |
| Tag der Prüfung: | 8 November 2010 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Pathologie |
| Themenverbund: | Nicht ausgewählt |
| Stichwörter / Keywords: | Urothelkarzinom, Harnblase, molekulare Prognosefaktoren, pT1, oberflächlich invasiv, Neoplasie, neoplasm, urothelial cancer, urinary bladder, molecular predictors, superficially invasive, CK20, p53, MIB-1, LOH, MSI, TP 53, FISH |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 17772 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Ziel dieser Dissertation war es, bei Urothelkarzinomen der Harnblase im Stadium pT1G2 oder G3 molekulare und genetische Untersuchungen durchzuführen und diese mit dem tumorspezifischen Überleben und dem rezidivfreien Überleben in Bezug zu setzen. Dabei wurde nach Zusammenhängen gesucht, die eine Hilfestellung beim Management der Tumorpatienten liefern könnten, da es zu den genannten Stadien ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Ziel dieser Dissertation war es, bei Urothelkarzinomen der Harnblase im Stadium pT1G2 oder G3 molekulare und genetische Untersuchungen durchzuführen und diese mit dem tumorspezifischen Überleben und dem rezidivfreien Überleben in Bezug zu setzen. Dabei wurde nach Zusammenhängen gesucht, die eine Hilfestellung beim Management der Tumorpatienten liefern könnten, da es zu den genannten Stadien invasive und konservative Therapieansätze gibt. Dazu wurden an 76 oberflächlich invasiven Urothelkarzinomen der Harnblase (Stadium pT1G2 und G3) mit Mikrosatellitenmarkern LOHs und MSIs auf dem Chromosom 8 sowie die Deletion von p16 auf dem Chromosom 9p21 und die Polysomie der Chromosomen 3, 7 und 17 mit der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungs-Technik analysiert. Diese wurden ergänzt durch immunhistochemische Färbung mit den Markern CK20, p53, MIB-1 sowie durch direkte Sequenzierung der Exons 5 bis 8 des TP53-Gens und FGFR3-Mutationsanalysen mit Hilfe der SNaPshot-Sequenzierung.
Als Substrat zur Gewinnung von DNA wurde formalinfixiertes und paraffineingebettetes Gewebsmaterial verwendet. Nach manueller Mikrodissektion wurde die DNA der Tumorzellen und auch die DNA des Normalgewebes isoliert. Für die Durchführung der LOH- und MSI-Analysen erfolgte die Amplifikation der DNA mit bis zu 7 Mikrosatellitenmarkern mit Hilfe der PCR und der nested-PCR. Die PCR-Amplifikate wurden mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und anschließend die Banden in einer Silberfärbung sichtbar gemacht. Als Weiteres wurden Stanzen aus demselben paraffineingebetteten Tumormaterial als Tissue-Micro-Arrays mit Hilfe der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung auf die Deletion von p16 und auf Polysomie mit Zentromersonden der Chromosomen 3, 7 und 17 hin untersucht.
Die Ergebnisse all dieser Untersuchungen wurden mit SPSS statistisch ausgewertet und in Bezug zum rezidivfreien Überleben und zum tumorspezifischen Gesamtüberleben gesetzt (Kaplan-Meier-Analysen):
In 19,7% der Tumoren wurden LOHs auf dem Chromosom 8 gefunden. Es zeigte sich eine MSI-Rate von 10% (7 Tumoren), wobei ein MSI-high und sechs MSI-low gefunden wurden. Es zeigte sich keine signifikante Assoziation zur Histopathologie oder zu den anderen untersuchten Markern und dem Outcome.
Die FISH-Analyse ergab eine p16-Deletion bei 69,4% der Tumoren und eine Polysomie bei 81,6%. p16 war nur mit dem Grading assoziiert, ansonsten gab es keine signifikanten Assoziationen der histopathologischen Parameter mit den Ergebnissen der FISH-Analyse. Dabei waren Polysomie und p16-Deletionen allerdings tendenziell gehäuft bei Tumoren mit ungünstiger Histopathologie.
Eine Mutation auf den Exons 5 bis 8 auf dem TP53-Gen wiesen 15,5% der Tumoren auf. Dabei zeigten sich keine signifikanten Korrelationen mit der Histopathologie oder dem Outcome.
39,7% der Tumoren zeigten eine FGFR3-Mutation, wobei 60,0% der G2- und 31,3% der G3-Tumoren Mutationen aufwiesen. FGFR3-Mutation kamen signifikant häufiger in Tumoren mit besserer Histopathologie vor (G2, kein Begleit-CIS, unifokal, papilläres Wachstumsmuster), wiesen aber ein kürzeres rezidivfreies Überleben auf. Dies widerspricht unter anderem mit der Studie von Zieger et al. (2005) den älteren Veröffentlichungen, die FGFR3-Mutationen einen positiven Effekt bezüglich des Rezidivs zugesprochen haben.
Die Auswertung der Immunhistochemie von CK20 ergab fast immer (63/65) eine dedifferenzierte Expression. Die beiden einzigen Tumoren mit normaler Expression wiesen tendenziell eine bessere Histopathologie auf. CK20 ist bei pT1-Tumoren also wahrscheinlich nur hilfreich, falls es normal exprimiert ist. Dann spricht es für eine gute Prognose.
Die immunhistochemische Auswertung von p53 und die TP53-Mutationsanalyse der Exons 5 bis 8 waren synergistisch, wobei jede einzelne Mutation exakt ihre Entsprechung (wie aus der Biochemie zu erwarteten) in der Immunhistochemie fand. Deshalb wurde ein spezifischerer Parameter definiert, der zwischen p53-alteriert (Mutation und/oder positive IHC) und nicht p53-alteriert (weder Mutation noch positive IHC) unterschied. Dabei waren p53-Alterationen häufiger bei Tumoren mit schlechterer Histopathologie, zeigten aber paradoxerweise diametral entgegengesetzt zu den bisherigen Literaturdaten ein längeres rezidivfreies und tumorspezifisches Überleben.
Die MIB-1-Expression war ebenfalls mit ungünstigerer Histopathologie korreliert und bestätigte damit seine Rolle als Progressionsmarker mit schlechterem tumorspezifischem Überleben. Das Ergebnis unserer Daten, dass eine hohe Proliferation zu einem längeren rezidivfreien Überleben führt, widerspricht dagegen den bisherigen Veröffentlichungen.
Das tumorspezifische Gesamtüberleben war signifikant länger (p = 0,0214) bei p53-Alterationen und vor allem bei der Kombination der letzteren mit einer niedrigen Proliferation (≤25%; p = 0,0001). Die restlichen Marker und Markerkombinationen schienen keinen oder weniger signifikanten Einfluss (p16-/p53-Alterationsstatus, p = 0,0204) zu besitzen.
Bezüglich der Aussagekraft für den Zeitraum bis zum Auftreten eines Rezidivs ergab sich Folgendes: Die Markerkombination aus FGFR3- und p53-Alterationsstatus (Kombination) beeinflusste das RFS signifikant (p = 0,0403), wobei fast allein der FGFR3-Status dafür verantwortlich war (p = 0,0545). Da FGFR3-Mutationen zwar mit histopathologisch günstigen Parametern assoziiert waren, scheinen bei pT1-Tumoren Alterationen hinzuzukommen, die die positiven Eigenschaften von FGFR3-Mutationen überwiegen. Damit sind FGFR3-Mutationen bei Urothelkarzinomen wahrscheinlich nicht a priori mit einem besserem Outcome assoziiert.
Sowohl das rezidivfreie als auch das tumorspezifische Überleben wurden von p53-Alterationen diametral entgegengesetzt beeinflusst, wie aus den bisherigen Veröffentlichungen zu erwarten war. Die gefunden Ergebnisse stellen unter Berücksichtigung der Literaturdaten die bis dato herausragende Rolle von p53 bei Urothelkarzinomen in Frage.
Einen „dritter“ Weg bei der Entstehung von Harnblasenkarzinomen (neben FGFR3- und p53-Alterationen) wäre eine gewagte, aber mögliche Deutung. Auch das gleichzeitige Auftreten von FGFR3-Mutationen und TP53-Mutationen ebenso wie die Koinzidenz von CIS und FGFR3-Mutation sprächen dafür. Die verantwortliche Alterationen müssten aber erst definiert werden.
Eingeschränkt werden die Ergebnisse durch Sachverhalte, die auch bei den anderen Veröffentlichungen zu diesem Thema zu kritisieren waren, vor allem aber die relativ geringe Zahl gesicherter nicht-tumorspezifischer bzw. tumorspezifischer Todesfälle in unseren Daten sowie das allgemein bekannte Problem der Vergleichbarkeit der Studien durch die Nicht-Standardisierung der Markererforschung. Darüber hinaus darf nicht vergessen werden, dass die jeweilige Therapie nach pT1-Diagnose (z. B. Chemotherapiefrühinstillation, Nachresektion, Zystektomie) das Outcome wesentlich beeinflusst. Diese Therapie war und ist einem stetigen Wandel unterworfen. Schon allein deswegen sind die Berechnungen zum rezidivfreien Überleben und dem tumorspezifischen Überleben sehr problematisch. Bei größeren Fallzahlen wäre eine Subgruppenanalyse sinnvoll.
Zusammenfassend zeigen die in der vorliegenden Arbeit untersuchten molekularen und genetischen Alterationen wie viele andere spezifische Moleküle mit veränderten Expressionsmustern in Blasentumoren, die bereits erprobt worden sind, gewisse Signifikanzen, liefern aber vor allem in Kombination die besten Aussagen über das Verhalten von pT1-Tumoren.
CK20, p16-Deletionen und Polysomie sowie LOH und MSI, die in dieser Dissertation beleuchtet wurden, lassen sich mit ihren Ergebnissen gut in die bisherigen Veröffentlichungen einreihen, stellen aber allein keine Prädiktoren für das Outcome von pT1-Urothelkarzinompatienten dar. Die gefundenen Ergebnisse von FGFR3 und p53 sowie Kombinationen mit deren Beteiligung sind widersprüchlicher, könnten aber mögliche neue Erkenntnisse bei der Entstehung von Urothelkarzinomen andeuten: FGFR3-Mutationen könnte nicht a priori eine bessere Prognose zugeschrieben werden; die Ergebnisse zu p53 sollten aufgrund der geringen Zahlen nicht überbewertet werden, stellen jedoch auch vor dem Hintergrund der bisher zahlreichen uneinheitlichen Veröffentlichungen dazu die herausragende Rolle von p53 beim Urothelkarzinom der Harnblase in Frage bzw. verlangen nach einer differenzierteren Betrachtung.
Dass generell ein einziger molekularer Marker für die Therapieentscheidung oder als Prognosemarker ausreicht, ist sehr unwahrscheinlich – vor allem vor dem Hintergrund der Komplexität der molekularen Interaktionen, die immer mehr aufgedeckt werden.
Alterationen, die ein entsprechendes Potential für eine spezialisierte Klassifikation oder ein molekulares Grading haben, können somit bisher nur als Ergänzung zur klassischen Histopathologie dienlich sein. Somit wird wahrscheinlich nur eine Kombination von mehreren Markern – sowohl molekularer wie histopathologischer Natur – zur Prognoseabschätzung von pT1G2/3-Urothelkarzinomen der Harnblase hilfreich sein. Dazu sind die standardisierte Prüfung neuer Marker beziehungsweise die weitere Testung von Kombinationen von Markern sowie – nicht zu vergessen – eine gute Zusammenarbeit zwischen Pathologen und Urologen für ein Vorwärtskommen auf diesem Gebiet unerlässlich.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The most appropiate therapy for superficially invasive urothelial carcinoma of the bladder (pT1) at initial diagnosis is controversy because it may run a variable course. The object of this study was to evaluate if molecular and genetic markers could be of prognostic value and supportive to clinical decision-making. For this reason 76 primary urothelial cancers of the bladder (pT1 G2/3) were ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The most appropiate therapy for superficially invasive urothelial carcinoma of the bladder (pT1) at initial diagnosis is controversy because it may run a variable course. The object of this study was to evaluate if molecular and genetic markers could be of prognostic value and supportive to clinical decision-making.
For this reason 76 primary urothelial cancers of the bladder (pT1 G2/3) were investigated for loss of heterozygosity using microsatellite markers on chromosome 8 and for deletions of p16 on chromosome 9p21 and polysomy of chromosomes 3, 7 an 17 using fluorescence in situ hybridization (FISH). Immunohistochemical (IHC) stainings with the markers CK20, p53 and MIB-1 and direct sequencing of the exons 5-8 of the TP53 gene as well as FGFR3 mutation analysis using the SnaPshot sequencing technique completed the analysis.
We used DNA from formalin fixed and paraffin embedded tissue samples. After manual microdissection tumor cell DNA as well as DNA from normal tissue were isolated. The DNA was amplified with 7 microsatellite markers using polymerase chain reaction (PCR) for the analysis of loss of heterozygosity (LOH) and microsatellite instability (MSI). PCR amplificates were separated by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and afterwards detected by a silver staining. Furthermore tissue microarrays (TMA) were constructed from all cases and used to investigate p16 deletions and polysomy using FISH (UrovysionTM, Abbott).
Cancer-specific survival (CSS) and recurrence-free survival (RFS) were correlated to the histopathological and molecular markers using Kaplan-Meier statistics.
19.7% of the tumors had LOHs on chromosome 8, the microsatellite instability (MSI) rate was 10%, 69.4% showed a p16 deletion and 81.6% polysomy. 15.5% had a mutation of the exons 5-8 on the TP53 gene. P16 was associated with poor differentiation. The other markers showed no significant associations with histopathology or the outcome.
39.7% of the tumors had a FGFR3 mutation, more often in G2 than in G3 cancers. Patients with mutations in FGFR3 had a shorter RFS, which is consent with only one previous study.
63 of 65 tumors showed a dedifferentiated CK20 expression, those with normal expression had a better prognosis.
Immunohistochemical staining of p53 and TP53 mutation analysis were synergistic. So a new parameter distinguishing between p53 altered (mutation and/or positive IHC) and non-altered (neither mutation nor positive IHC) was defined. P53 altered tumors showed a worse histopathology, but paradoxically a better outcome.
MIB-1 expression proved its role as a marker for progression, but showed a longer RFS.
CSS was significant longer at p53 altered tumors (p = 0,0204) and especially in combination with a low MIB-1 expression. The other marker and marker combinations showed no significant impact on the outcome.
The combination of FGFR3 mutation and p53 alteration as well as FGFR3 status alone showed a worse RFS (although FGFR3 mutations are associated with better histopathology).
The outstanding role of p53 in the development of urothelial cancer has to be questioned. A „third“ way in addition to the FGFR3 and p53 alterations would be a possible interpretation. The coincidence of FGFR3 and TP53 mutations as well as the coincidence of CIS and FGFR3 mutations would support this. The responsible alterations have not been defined yet.
This analysis - like all publications to this issue - are limited by the same problems, especially by the low number of cancer specific death and the non-comparability of the studies because of non-standardization of marker research. Beyond this the primary therapy after first diagnosis of pT1 urothelial cancer also impacts the outcome.
In summary the molecular and genetic alterations investigated in this study confirmed – as expected from previous studies - some statistical associations, especially in combination of the markers. The results for FGFR3 mutations and p53 are contradictory but could adumbrate new findings:
FGFR3 mutation could not be associated with better outcome a pirori. The inconsistent data in literature query the outstanding role of p53 in urothelial cancer and demand a differentiated reflection respectively.
That a single molecular marker could be helpful in therapy decision-making or as prognostic marker is improbable – against the background of the complexity of molecular interactions detected more and more. Alterations can only be additive to histopathology so far. Therefore only a combination of histopathological and molecular markers will be appropriate. To this the standardized investigation of new markers as well as testing of new marker combinations and – not to forget – a good cooperation between pathologists and urologists is necessary to make progress.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 08:02
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