| License: Publishing license for publications including print on demand (3MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-184134
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.18413
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 13 January 2012 |
| Referee: | Prof. Dr. Otto Wolfbeis and Prof. Dr. Marina Kreutz |
| Date of exam: | 16 December 2010 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Innere Medizin III (Hämatologie und Internistische Onkologie) Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Chemo- und Biosensorik (Prof. Antje J. Bäumner, formerly Prof. Wolfbeis) |
| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
| Keywords: | Laktat, lactate, Tumormetabolismus, aerobe Glykolyse, Warburg, aerobe glycolysis, LDHA, LDHA-defizient, ldha-deficient, tumor, tumor metabolism, glycolysis, metabolisches Profil, metabolic profiling, RT-qPCR, shRNA, DNA |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences 500 Science > 570 Life sciences 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 18413 |
Abstract (German)
Dysregulationen in Stoffwechselwegen, wie z.B. dem Glukosemetabolismus, die eine Anreicherung von Metaboliten wie Laktat im Tumormilieu verursachen, sind typisch für Tumore. Unsere Arbeitsgruppe konnte mehrfach zeigen, dass Laktat die Reifung und Funktion von Immunzellen moduliert. Erstes Ziel dieser Arbeit war es, ein metabolisches Profil dysregulierter Stoffwechselwege in Tumorzelllinien im ...
Abstract (German)
Dysregulationen in Stoffwechselwegen, wie z.B. dem Glukosemetabolismus, die eine Anreicherung von Metaboliten wie Laktat im Tumormilieu verursachen, sind typisch für Tumore. Unsere Arbeitsgruppe konnte mehrfach zeigen, dass Laktat die Reifung und Funktion von Immunzellen moduliert. Erstes Ziel dieser Arbeit war es, ein metabolisches Profil dysregulierter Stoffwechselwege in Tumorzelllinien im Vergleich zu Normalzellen auf genetischer Ebene zu erstellen. Dazu sollten die entsprechenden Metaboliten in Zellkulturüberständen nachgewiesen werden. Hierzu wurden mehrere Tumorzelllinien unterschiedlicher Herkunft mit RT-qPCR auf die RNA-Expression entsprechender Gene untersucht. Es zeigte sich, dass Tumorzelllinien keine starken Veränderungen im
Lipidstoffwechsel (COX1 und COX2) gegenüber Immunzellen zeigten. Interessanterweise war aber COX2 insbesondere in primären Monozyten stark exprimiert. Da COX2 laut Literatur im Tumor häufig überexprimiert ist, könnte dies darauf hindeuten, dass nicht Tumorzellen selbst, sondern infiltrierende Immunzellen für die Überexpression mitverantwortlich sind. Ähnliches zeigte sich bei Expression wichtiger Enzyme des Aminosäurestoffwechsels, der IDO1, der iNOS sowie der ARG2. Weiterhin wurden verschiedene Enzyme, des Glukosestoffwechsels analysiert. Hier waren LDHA sowie GLUT1 verstärkt in den Tumorzelllinien exprimiert. Zudem fanden wir eine gegenüber Normalzellen gesteigerte Laktatsekretion von Tumorzellen. Dem gegenübergestellt wurden mit Hilfe der PreSens-Technologie Sauerstoffverbrauch und pH-Änderungen des Kulturmediums im Zeitverlauf bestimmt und wir fanden, dass die analysierten Tumorzellen eine deutliche Atmungsaktivität aufwiesen. Auch auf mRNA-Ebene konnte die Expression der PDH sowie der MDH eine mitochondriale Aktivität der untersuchten Tumorzelllinien bestätigen. Dies deutet darauf hin, dass in Tumoren eine hohe Glykolyserate nicht unbedingt mit einer niedrigen Respiration korreliert ist.
Da Tumorzelllinien nur ein Modellsystem für primäre Tumore darstellen, wurde im Anschluss daran das metabolische Profil verschiedener primärer Tumore analysiert. Hierbei wurden Biopsien unterschiedlicher Tumortypen verwendet und mit dem entsprechenden Normalgewebe derselben Patienten verglichen. Im Fall des Nierenzellkarzinoms bestätigten sich die Zellkulturanalysen und wir konnten zeigen, dass LDHA, GLUT1 und MCT1 im Tumorgewebe auf mRNA- und Proteinebene überexprimiert ist. Hier konnten wir auch eine Korrelation zwischen einer hohen GLUT1-Expression und einer schwachen Infiltration von CD8+ T-Zellen nachweisen [108]. LDHB war dagegen im Tumorgewebe erniedrigt. Im Urothel- und hepatozellulären Karzinom waren GLUT1 und LDHA tendenziell erhöht. Dies deutet darauf hin, dass der Warburg-Phänotyp nur bei bestimmten Tumoren stark ausgeprägt ist. Auch die IDO1 war im Nierenzellkarzinom überexprimiert, nicht aber COX1/2 sowie ARG1 oder iNOS.
Die Abhängigkeit des Tumorwachstums von einer gesteigerten Glykolyse wurde anschließend in vitro untersucht. In MelIm und B16.SIY E12 wurde die Glykolyse und die Expression der LDHA sowohl pharmakologisch als auch genetisch supprimiert. Es zeigte sich, dass die pharmakologische Suppression der Glykolyse mittels 2-DG deutlich das Tumorwachstum in vitro inhibiert. Hierzu wurde der synergistische Effekt von 2-DG mit Dexamethason untersucht. Zusätzlich wurde die Expression der LDHA mittels shRNA-Konstrukt in MelIm und B16.SIY E12 stabil herunterreguliert. Dies hatte in vitro keinen Effekt auf das Tumorwachstum. Im Vergleich dazu wurden dieselben Zelllinien in immundefiziente Rag1-/- -Mäuse injiziert und deren Wachstumsverhalten in vivo untersucht. In den Rag1-/- -Mäusen zeigen die LDHA-herunterregulierenden Klone keine nennenswerten Wachstumsdifferenzen im Vergleich zu den Kontrollen, wie auch schon in vitro beobachtet.
Die genetisch veränderten murinen Zelllinien wurden auch in immunkompetente C57/BL6-Mäuse mit verschiedenen Zelldichten injiziert. Dabei konnte bei allen Zelldichten beobachtet werden, dass die Kontrollzellen wesentlich größere Tumore bildeten als die LDHA-herunterregulierenden Tumorzellen. Zudem war die Tumoranwachsrate in niedrigen Zelldichten bei den wenig Laktat sezernierenden Klonen im Vergleich zu den Kontrollen deutlich geringer als in hohen Zelldichten. Dies könnte bedeuten, dass die verringerte Laktatsekretion starke Auswirkungen auf T-Zellen hat und somit das Tumorwachstum in der immunkompetenten Maus kontrolliert.
Diese Experimente in immunkompetenten und immundefizienten Mäusen deuten auf einen immunsuppressiven Effekt des Laktats in vivo hin. Veränderungen im Stoffwechsel von Tumoren werden momentan hauptsächlich diagnostisch genutzt, bieten aber in Zukunft interessante Ansätze zur Therapieentwicklung. Besonders der Glukosemetabolismus stellt hier ein interessantes Ziel für die Entwicklung von Kombinationstherapien, zusammen mit Strahlen-, Chemo-, oder Vaccinierungstherapien, dar.
Translation of the abstract (English)
Dysregulated metabolic pathways are typical for tumors. Especially the glucose metabolism is altered in many tumor entities, a finding that was described many years ago by Otto Warburg. The accelerated glycolysis leads to an accumulation of lactate in the tumor environment which is associated with a bad prognosis. This may in part be due to the fact that lactate modulates the maturation and ...
Translation of the abstract (English)
Dysregulated metabolic pathways are typical for tumors. Especially the glucose metabolism is altered in many tumor entities, a finding that was described many years ago by Otto Warburg. The accelerated glycolysis leads to an accumulation of lactate in the tumor environment which is associated with a bad prognosis. This may in part be due to the fact that lactate modulates the maturation and activation of immune cells, which could be shown by our group. One aim of this investigation was to analyze dysregulated metabolic pathways in tumor cell lines and primary tumors compared to normal cells. In addition, corresponding metabolites should be determined in cell culture supernatants.
Several tumor cell lines of different origins were analyzed by RT-qPCR. Regarding the lipid metabolism, we analyzed COX1 and COX2. The results did not show any significant differences between tumor cells and untransformed cells. Especially COX2 was highly expressed not only in tumor cells but also in primary human monocytes. This might indicate that not only the tumor cells themselves, but also infiltrating immune cells are responsible for the overexpression of COX2 in tumors. Furthermore, we found that important enzymes of the amino acid metabolism like IDO1, iNOS as well as ARG2 were also strongly expressed in immune cells. The strongest differences in gene expression were detected in genes related to the glucose metabolism. LDHA and GLUT1 mRNA-expression were significantly upregulated in tumor cell lines and an increased lactate secretion of the tumor cell lines compared to normal cells was determined. High rates of glycolysis were not linked to low oxygen consumption as most of the analyzed tumor cell lines clearly consumed oxygen. The high expression of the PDH and the MDH on mRNA-level confirmed the mitochondrial activity of the analyzed tumor cell lines. This indicates that a high glycolysis rate does not always correlate with a low respiration in tumors. Because tumor cell lines present only a model system for primary tumors, the metabolic profile of different primary tumors was analyzed next. Tumor biopsies of different origins were used and compared with the corresponding normal tissue of the same patient. Analyses of renal cell carcinoma (RCC) biopsies confirmed our cell culture data as LDHA, GLUT1 and MCT1 were overexpressed on mRNA- and protein-level in the tumor tissue. In contrast, LDHB was lower expressed in the tumor tissue. In addition, we could show that high GLUT1 expression correlated with a low infiltration of CD8+ T-cells in RCC biopsies. Beside a high expression of genes involved in glycolysis, IDO1 was also overexpressed in the RCC biopsies compared to normal renal tissue. No differences were found regarding COX1/2 and ARG1/iNOS expression.
We also analyzed some urothelial carcinoma and hepatocellular carcinoma biopsies and found a trend for a higher GLUT1 expression in hepatocellular carcinoma and increased LDHA expression in urothelial carcinoma. This indicates that the Warburg-phenotype is less pronounced in certain tumors.
Next we analyzed the impact of pharmacologic as well as genetic inhibition of glycolysis on tumor growth in vitro and in vivo. Pharmacologic suppression of glycolysis by 2-DG and other inhibitors severely inhibited tumor cell proliferation in vitro and we could demonstrate a synergistic effect of dexamethasone and 2-DG. LDHA was also downregulated by means of shRNA technology in the human melanoma cell line MelIm and in the murine melanoma cell line B16.SIY E12. The downregulation of LDHA led to a decrease in lactate secretion but had no significant effect on tumor growth in vitro. In immunodeficient Rag1-/- -mice, lacking B-lymphocytes and T-lymphocytes, LDHA low expressing clones did also show no differences in tumor growth. However, injection into immunocompetent C57/BL6-mice resulted in an impaired growth of LDHA low expressing tumor cells. In addition, tumor take of these clones was lower compared to the control clones. This indicates that the tumor metabolism/lactate secretion influences the activity of T-cells and thereby controls tumor growth in the immunocompetent mouse.
Up to now, alterations in the tumor metabolism are primarily used for diagnostic purposes. In the future these differences may offer interesting possibilities for the development of therapies. Especially the glucose metabolism is an interesting target for tumor therapy together with radiation, chemo- or immunotherapies.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 15:19
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