Frank, Eva-Maria
(2010)
Die Wirkung eines dentalen Monomers auf die Expression von mitogen-aktivierten Proteinkinasen.
PhD, Universität Regensburg.
Date of publication of this fulltext: 03 Dec 2010 15:14
Abstract (German)
Biologisch nachteilige Effekte kunststoffbasierter dentaler Füllungsmaterialien in eukaryontischen Zellen basieren in erster Linie auf molekularen Mechanismen der zellulären Reaktion. Die vermehrte intrazelluläre Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) als Folge einer Exposition von Zellen gegen dentale Monomere stört die zelluläre Redoxhomöostase. In der Folge werden beispielsweise in ...
Abstract (German)
Biologisch nachteilige Effekte kunststoffbasierter dentaler Füllungsmaterialien in eukaryontischen Zellen basieren in erster Linie auf molekularen Mechanismen der zellulären Reaktion. Die vermehrte intrazelluläre Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) als Folge einer Exposition von Zellen gegen dentale Monomere stört die zelluläre Redoxhomöostase. In der Folge werden beispielsweise in Zellen oraler Gewebe Signalwege aktiviert, die das Überleben von Zellen regulieren, wie die Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3-K) oder der Transkriptionsfaktor NFκ-B. Auch spezifische Funktionen von Zellen des Immunsystems werden durch Monomere beeinträchtigt. So können beispielsweise die MAPK-abhängige Expression von Oberflächenantigenen oder die Freisetzung pro- und antiinflammatorischer Zytokine nach Stimulation der Zellen mit dem Endotoxin Lipopolysaccharid (LPS) aus pathogenen Organismen inhibiert werden.
Mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAPK) dienen, zusammengeschlossen zu Kaskaden, als eine Signalkette, der Steuerung der Homöostase in Zellen. Die MAP-Kinasen ERK1/2, JNK und p38 sind besonders gut erforscht. Sie haben Einfluss auf die Regulation von Signalwegen, die dem Überleben von Zellen dienen, oder aber in Zellen Apoptose induzieren. Sie steuern aber auch wichtige Zellfunktionen wie die Zellproliferation und sind für die Regulation der Immun- und Stressantwort von großer Bedeutung. Erhöhte Mengen an ROS beeinflussen diese MAP-Kinasen, wodurch es überwiegend zur Aktivierung der SAPK (Stress-aktivierte Proteinkinasen) JNK und p38, sowie zur Induktion von Apoptose kommt.
Ziel dieser Studie war es, den Einfluss des Kunststoffmonomers TEGDMA auf die Aktivierung der MAP-Kinasen p38, JNK und ERK1/2 zu untersuchen. Von besonderem Interesse war die Kinetik dieser Aktivierung oder Inaktivierung. Schließlich sollte auch der zeitabhängige Zusammenhang zwischen der Aktivierung oder Inaktivierung der MAP-Kinasen und dem Übergang von Zellen in Apoptose diskutiert werden.
Die experimentelle Durchführung erfolgte ausschließlich mittels der gut charakterisierten Makrophagenzelllinie RAW264.7. Die Zellen wurden dem Monomer TEGDMA (3 mM) und LPS und einer Kombination von TEGDMA/LPS für 15 und 30 Minuten sowie für 1, 2, 6 und 24 Stunden exponiert. Anschließend wurden die phosphorylierten MAPK und die Gesamtmenge an MAPK (phosphorylierte und nicht-phosphorylierte Form) mit spezifischen Antikörpern mittels Western Blot nachgewiesen. Als Maß der Aktivierung der MAPK wurde das Verhältnis der phosphorylierten MAPK und der Gesamt-MAPK errechnet.
Die MAP-Kinasen p38, ERK1/2 und JNK unterschieden sich sowohl in Abhängigkeit von der Expositionszeit als auch in der Stärke der Aktivierung oder Inaktivierung. ERK1/2, p38 and JNK wurden unterschiedlich stark in Anwesenheit von LPS (0.1 µg/ml), und TEGDMA (3 mM) aktiviert.
Die MAPK p38 wurde nach kurzen Expositionszeiten von 30 Minuten mit TEGDMA nur schwach um den Faktor 1,8 aktiviert, während eine Aktivierung von ERK1/2 und JNK unter gleichen Bedingungen gänzlich ausblieb. Nach einer Expositionszeit von 2 Stunden wurde p38 kaum aktiviert (Faktor 1,2). Die Phosphorylierung von ERK1/2 wurde durch eine zweistündige TEGDMA-Exposition inhibiert. Die MAP-Kinase JNK zeigte nach 2 Stunden Exposition keine Aktivierung oder Inaktivierung. Nach einer Expositionszeit von 6 Stunden fand sich bei p38 eine Aktivierung, die sich kaum von derjenigen nach 30 Minuten unterschied (Faktor 1,9 im Vergleich zu Faktor 1,8). Exponierte man Zellen jedoch für 24 Stunden TEGDMA, so zeigte sich ein enormer Anstieg der Aktivierung von p38 um den Faktor 15,1. ERK1/2 verhielt sich ähnlich. Auch hier wurde nach 6 Stunden keine nennenswerte Phosphorylierung beobachtet, jedoch wurde nach 24 Stunden auch eine Steigerung um den Faktor 15,1 erzielt. Die SAPK JNK wurde nach 6 Stunden Exposition gegen TEGDMA ebenfalls nicht aktiviert (Faktor 0,8). Im Unterschied zu p38 und ERK1/2 fand sich aber bei JNK nach 24 Stunden Exposition nur eine geringe Aktivierung um den Faktor 1,3.
Analysen zur Induktion von Apoptose durch TEGDMA, die parallel zu den Nachweisen der MAPK durchgeführt wurden, zeigten einen Zusammenhang zwischen der Aktivierung der MAPK p38 und ERK1/2 und der TEGDMA-induzierten Apoptose. Hierbei stieg die Zahl der Makrophagen, die in Apoptose und Nekrose übergingen prozentual mit der Expositionszeit. Damit wurde eine Korrelation, wenn auch kein kausaler Zusammenhang zwischen der Aktivierung von MAPK und der Induktion von Apoptose durch TEGDMA gefunden.
Die Genotoxizität sowie die Zytotoxizität des Monomers TEGDMA aber auch von HEMA (2-Hydroxyethylmethacrylat) in verschiedenen Zelllinien wurden durch frühere Arbeiten häufig nachgewiesen. Mit der Charakterisierung der Kinetik der Aktivierung von MAPK und der Korrelation zur Induktion von Apoptose in der vorliegenden Arbeit wurde ein weiterer Schritt zur Erklärung von Mechanismen der biologischen Wirkung dentaler Monomere geleistet. Es gilt nun den noch fehlenden kausalen Zusammenhang durch geeignete Forschungsansätze wie beispielsweise mittels pharmakologischer und genetischer Inhibitoren der hier diskutierten MAPK zu untersuchen.
Translation of the abstract (English)
Adverse effects of dental resin materials in eukaryotic cells are based on molecular mechanisms of cellular reactions. It has been observed that elevated intracellular levels of reactive oxygen species (ROS) as a result of an exposure of cells towards dental monomers like TEGDMA (triethylene glycol dimethacrylate) disturb the cellular homeostasis. Subsequently, signaling pathways regulating cell ...
Translation of the abstract (English)
Adverse effects of dental resin materials in eukaryotic cells are based on molecular mechanisms of cellular reactions. It has been observed that elevated intracellular levels of reactive oxygen species (ROS) as a result of an exposure of cells towards dental monomers like TEGDMA (triethylene glycol dimethacrylate) disturb the cellular homeostasis. Subsequently, signaling pathways regulating cell survival like the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) or the transcription factor NFκ-B are activated in, for instance, cells of the oral cavity in vitro. Likewise, specific functions of the innate immune system are apparently modified by monomers. For example, the LPS-stimulated mitogen-activated protein kinase-dependent expression of surface antigens as well as pro- and anti-inflammatory cytokines is inhibited in the presence of TEGDMA.
The mitogen-activated protein kinases (MAPK) ERK1/2, JNK and p38 are central to the regulation of cell homeostasis. Activation of MAPK controls a variety of cell responses including cell proliferation, differentiation, survival, or apoptosis. MAPK regulate specific functions of the innate immune system and cellular stress responses. Moreover, it has been shown earlier that increased levels of ROS modify MAPK activities leading predominantly to the activation of the SAPK (stress-activated protein kinases) JNK and p38 and the induction of apoptosis.
Therefore, the aim of this study was to investigate the influence of the resin monomer TEGDMA on the activation of p38, JNK and ERK1/2. The kinetic of activation or inactivation was of particular importance. Finally, the time-dependent relation between the activation or inactivation of MAPKs and the onset of apoptosis by TEGDMA are discussed. All experiments were carried out exclusively by means of the well characterized mouse macrophage cell line RAW264.7. The cells were exposed to the monomer TEGDMA (3 mM) and LPS (0.1 µg/ml) and a combination of TEGDMA / LPS for 15 and 30 minutes and for 1, 2, 6 and 24 hours. Subsequently, the phosphorylated MAPK and the total amounts of MAPK (phosphorylated and non-phosphorylated form) were detected with specific antibodies by Western blotting. As a measure of activation of the MAPK, the ratio of phosphorylated MAPK to total MAPK was calculated.
All MAPKs were differentially expressed depending on the exposure period and the presence of LPS (0.1µg /ml) and TEGDMA (3 mM). MAPK p38 was only weakly activated by a factor of 1.8 after short exposure periods to TEGDMA for 15 and 30 min, while activation of ERK1/2 and JNK under the same conditions failed to appear. After a 2h exposure p38 was barely activated by the monomer (1.2 times). The phosphorylation of ERK1/2 was inhibited by a 2h TEGDMA-exposure, and JNK was not activated. After a 6h exposure activation was found in p38, which differed little from that after 30 minutes (factor of 1.9). However, in cells exposed to TEGDMA for 24h, an enormous increase in the activation of p38 by a factor of 15.1 was detected. The activation of ERK1/2 was very similar, because no significant phosphorylation of ERK1/2 was observed after 6h, however, an increase by a factor of 15.1 could be detected after 24h. The SAPK JNK was not activated after a 6 h exposure period to TEGDMA (factor 0.8). In contrast to p38 and ERK1/2, JNK was only weakly activated by a factor of 1.3 after 24h. The induction of apoptosis by TEGDMA analyzed in parallel to the investigations of the activation of MAPKs was timely correlated to the activation of p38 and ERK1/2. In this case, the number of macrophages in apoptosis and necrosis proportionally increased with exposure time. Thus, a correlation but no causal relationship between the activation of MAPK and the induction of apoptosis by TEGDMA was found so far. Genotoxicity and cytotoxicity of TEGDMA and HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate) in various cell lines was detected in earlier investigations. By characterizing the kinetics of the activation of MAPK and the correlation to the induction of apoptosis a further step has been made to explain the mechanisms of biological effects of dental monomers. The causal relation between the monomer-induced activation of MAPK and apoptosis is now the missing link to be investigated through appropriate research approaches such as the use of pharmacologic and genetic inhibitors of MAPK activity.
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