| License: Publishing license for publications excluding print on demand (3MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-187996
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.18799
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 22 October 2011 |
| Referee: | Prof. Dr. Ralf Wagner |
| Date of exam: | 16 November 2010 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
| Keywords: | Optimierung, Protein, Darwin, Evolution, in vivo, autonom, kontinuierlich, yeast two-hybrid, RNA-abhängige RNA-Replikase, Oligonukleotid, activation-induced cytidine deaminase; optimization, protein, evolution, RNA-dependent RNA replicase, oligonucleotide |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 18799 |
Abstract (German)
Die zielgerichtete Optimierung von Protein-Protein-Interaktionen (z. B. bei der Signaltransduktion oder Antigen-Antikörper-Bindung) spielt in vielen Bereichen von Medizin bis hin zur Industrie eine immer bedeutendere Rolle. Herkömmliche in vitro-Verfahren beruhen auf getrennten Mutations- und Selektionssystemen, mit denen die enorme Menge an potentiell möglichen Varianten nicht durchmustert ...
Abstract (German)
Die zielgerichtete Optimierung von Protein-Protein-Interaktionen (z. B. bei der Signaltransduktion oder Antigen-Antikörper-Bindung) spielt in vielen Bereichen von Medizin bis hin zur Industrie eine immer bedeutendere Rolle. Herkömmliche in vitro-Verfahren beruhen auf getrennten Mutations- und Selektionssystemen, mit denen die enorme Menge an potentiell möglichen Varianten nicht durchmustert werden kann, so dass der beste Binder unter Umständen nicht identifiziert wird. Statt einmalig eine große Menge an Varianten zu generieren, finden in der Natur über Generationen hinweg einzelne Gen-Mutationen statt, die sich in der Summe im Genpool durchsetzen, wenn sie dem Organismus einen Überlebensvorteil verschaffen. Ziel dieser Arbeit war es, in Anlehnung an die Darwin´sche Evolution ein autonomes, kontinuierliches Evolutionssystem bestehend aus räumlich und zeitlich gekoppelter Mutagenese, Selektion und Replikation zu etablieren, um damit in Saccharomyces cerevisiae die Affinität von zwei Interaktionspartnern über zahlreiche Generationen schrittweise zu verbessern. Das sollte erreicht werden, indem spezifisch das Zielgen (prey) zufällig an beliebigen Positionen mutiert wird und gleichzeitig eine Selektion mittels yeast two-hybrid (Y2H) Interaktion in Flüssigkultur stattfindet. Die verbesserte Protein-Protein-Interaktion verleiht der Hefezelle einen Wachstumsvorteil, wodurch sich die Interaktionsstärke in der Wachstumsgeschwindigkeit widerspiegelt und die „Gewinner“ unter Selektionsbedingungen bevorzugt repliziert werden.
Am Beispiel von RNA-abhängigen RNA Replikasen wurde die Entwicklung eines autonomen Replikons als Mutationssystem vorangetrieben. Da die template-Eigenschaften der autologen Hefeviren 20S und 23S noch relativ unerforscht sind, gestaltete sich der Aufbau durch rationales template-Design als komplex. Der Qbeta-Replikasekomplex, der bakterielle Wirtsfaktoren benötigt, wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal in einem eukaryontischen Organismus funktionell exprimiert. Die Entwicklung eines stabilen RNA-Replikons in der Bäckerhefe war aufgrund der noch unzureichend bekannten Anforderungen für eine spezifische template-Erkennung jedoch nicht möglich.
Basierend auf der Oligonukleotid-vermittelten Mutagenese wurde ein äußerst sequenzspezifisches Evolutionssystem etabliert. Die Mutationen können – mit oder ohne Berücksichtigung von Kenntnissen der Proteineigenschaften – präzise in die prey-DNA eingeführt und darüber hinaus auf definierte Sequenzabschnitte begrenzt werden, wobei jede Position einer beliebigen Mutationswahrscheinlichkeit unterworfen werden kann. Nach einer Evolutionsrunde, bestehend aus Hefe-Transformation mit Oligonukleotid-Bibliotheken und Selektion in Flüssigkultur mit ansteigendem Selektionsdruck wurden Hefen mit Interaktionspaaren angereichert, deren bait-prey-Affinität bis zu 400-fach verbessert wurde. Die Bedingung der Kontinuität wäre dann erfüllt, wenn die Aufnahme der degenerierten Oligonukleotide während des Hefewachstums ständig erfolgt oder weitere Runden bestehend aus Transformation von prey-Varianten-spezifischer Oligonukleotid-Bibliotheken und Selektion folgen.
Durch Kombination der humanen activation-induced cytidine deaminase (AID) mit dem Y2H System ist die Etablierung eines autonomen und kontinuierlichen Evolutionssystems gelungen. Dazu wurde ein Hefestamm, der mutagene AID stabil exprimiert, mit bait- und prey-Plasmid-DNA transformiert und über zahlreiche Generationen hinweg unter steigenden Selektionsbedingungen kultiviert. Hefen mit einem besseren Bindepaar wurden generiert und reicherten sich in der Kultur zu 100% an, was durch den Verlauf der Wachstumsrate beobachtet werden konnte. Indem prey mutiert wurde, wurde aus einem schwachen Interaktionspaar mit einer Affinität im µ-molaren Bereich ein 4,5-fach stärkerer Bindepartner erzeugt. Durch Erhöhung der prey-Mutationswahrscheinlichkeit, was beispielsweise über die Steigerung der AID-Aktivität erreicht werden kann, könnte dieses Evolutionssystem optimiert werden, um im gleichen Zeitraum mehr Varianten und somit potentiell noch bessere Binder zu erzeugen.
Translation of the abstract (English)
Directed optimization of protein-protein-interactions (e. g. signal transduction or antigen-antibody binding) plays a key role in many areas from medicine to industry. Conventional in vitro-techniques are based on separated mutation and selection systems. These conservative methods are not suitable to screen the tremendous amount of theoretical possible variants, thus potentially the best binder ...
Translation of the abstract (English)
Directed optimization of protein-protein-interactions (e. g. signal transduction or antigen-antibody binding) plays a key role in many areas from medicine to industry. Conventional in vitro-techniques are based on separated mutation and selection systems. These conservative methods are not suitable to screen the tremendous amount of theoretical possible variants, thus potentially the best binder cannot be identified. Instead of generating a high amount of variants at once, in nature single gene mutations take place over many generations which in sum accomplish in the gene pool if they are advantageous for the organism. The aim of this work was to establish an autonomous, continuous evolution system based on Darwinian evolution, consisting of spatially and temporally coupled mutagenesis, selection and replication, and to use this system for improving the affinity of two interacting proteins in Saccharomyces cerevisiae within many generations. This should be achieved by mutating specifically the target gene (= prey) in any position and at the same time performing the selection via yeast two-hybrid (Y2H) interaction in liquid culture. The improved protein-protein-interaction provides growth advantage to the yeast cell, the interaction strength correlates with the yeast growth rate and the “winners” replicate preferentially under selection pressure.
Using the example of RNA-dependent RNA replicases, the development of an autonomous replicon as a mutagenic system was expedited. Because little is known about the template characteristics of the autologous yeast viruses 20S and 23S, the assembling via rational template design was demanding. The Qbeta-replicase complex which needs bacterial cofactors was functionally expressed in an eukaryotic organism for the first time in this work. However the development of a stable RNA-replicon in baker´s yeast was not possible, because too less is known about the requirement of specific template recognition.
Based on oligonucleotide-mediated mutagenesis an highly sequence specific evolution system was established. Mutations can be placed precisely in prey-DNA – optional considering protein characteristics – and furthermore can be limited on defined sequence regions, whereas each position can be mutated by user-defined mutation probability. Performing one evolution round, consisting of yeast transformation with oligonucleotide-libraries and selection in liquid culture with rising selection pressure, yeast clones harboring interaction pairs with up to 400-fold enhanced bait-prey affinity were selected. The condition of continuity would be fulfilled if the oligonucleotide uptake was continuous during yeast growth or alternatively, further rounds of transformation of prey variant specific oligonucleotide-libraries and selection were carried out.
Combining human activation-induced cytidine deaminase (AID) and Y2H system, an autonomous and continuous evolution system was established. Hence a yeast strain expressing mutagenic AID was transformed with bait and prey plasmid DNA and cultivated over many generations with rising selection pressure. Yeast clones harboring an improved protein interaction pair were generated and enriched in the culture up to 100% which could be observed via the rising growth rates. Prey was mutated, thus improving the weak interacting protein pair with a µmolar affinity up to 4.5-fold. By increasing prey’s mutagenic probability which can be achieved by enhancing AID activity, this evolution system could be further optimized to produce more variants in the same time and as a result to generate a potentially even better binder.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 07:50
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