| License: Publishing license for publications including print on demand (3MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-206831
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.20683
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 4 May 2011 |
| Referee: | Prof. Dr. Karl Kunzelmann |
| Date of exam: | 24 March 2011 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Physiologie > Prof. Dr. Karl Kunzelmann |
| Keywords: | CFTR, Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, AMPK, PKA, ion transport, phosphorylation, AMP-activated protein kinase, S573C, pancreatitis, pancreas, chloride secretion, acid, proton, F508del-CFTR, CaCC, TMEM16A |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 20683 |
Abstract (English)
Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) is a cAMP dependent Cl- channel that is expressed mainly on the apical membrane of epithelial cells. CFTR plays an essential role in electrolyte and water homeostasis. Defects in CFTR cause CF disease, which is the most common lethal genetic disorder among Caucasians. Besides functioning as a Cl- channel, CFTR also acts as a regulator of ...
Abstract (English)
Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) is a cAMP dependent Cl- channel that is expressed mainly on the apical membrane of epithelial cells. CFTR plays an essential role in electrolyte and water homeostasis. Defects in CFTR cause CF disease, which is the most common lethal genetic disorder among Caucasians. Besides functioning as a Cl- channel, CFTR also acts as a regulator of other channels and transporters. Although CFTR has been known for more than 20 years, many questions regarding CFTR regulations and functions remain to be answered. In the present thesis, we performed various experiments in an attempt to understand CFTR in several aspects, including CFTR-regulation by AMPK in vitro and in vivo, the role of the S573C CFTR mutation for the risk to develop pancreatitis, and a novel role of CFTR in proton sensing and regulating CaCC.
Regulation of CFTR by AMPK in vivo
The present study has clarified the role of AMPK for epithelial Cl- transport in vivo using AMPKα1-/- mice. The data demonstrate a significant role of AMPK in regulating CFTR. In real short circuit Ussing chamber experiment, an increase in CFTR Cl- current is observed in the colon of AMPKα1-/- mice when exposed to cAMP. Unlike wild type littermates, the elevated cAMP-dependent Cl- current in the AMPKα1-/- colon is insensitive to the AMPK activator phenformin. Furthermore, rectal potential difference (RPD) measurements indicate that AMPKα1-/- mice have an increased RPD both non-stimulated and after exposure to cAMP. These data suggested enhanced activity of CFTR in the large intestine of AMPKα1-/- mice. In correlation to previous in vitro observations, data from the present study demonstrate that AMPK inhibits CFTR in vivo.
Mechanistic insight into control of CFTR by AMPK
To identify the AMPK phosphorylation sites in CFTR and to find the mechanisms underlying AMPK regulation of CFTR, Xenopus oocytes were used to overexpress different CFTR mutations, and the whole cell currents of the overexpressed oocytes were measured using the double electrode voltage clamp (DEVC) technique. In contrast to previous observations, this study demonstrates that S737 and S768 are phosphorylated by AMPK rather than PKA. In Xenopus oocytes, single or multiple mutations of S737 and S768 to alanine increase CFTR whole cell currents around 4-fold. Moreover, in non-activated cells, S737A and S768A increase the basal CFTR Cl- conductance around 5-fold. The elevated conductance is insensitive to the AMPK inhibitor phenformin and the AMPK activator compound C. Taken together, we demonstrate that AMPK inhibits PKA activation of CFTR. Moreover, AMPK indeed constitutively phosphorylates CFTR and keeps the channel shut at basal levels. We associated this finding to a spatiotemporal regulation of CFTR by cAMP. Data from the present study suggest a constitutive inhibition of CFTR by a tonic baseline AMPK activity. Because AMPK can also be activated without any detectable changes in the global AMP/ATP ratio, it is likely that AMPK regulation of CFTR is also controlled locally. The scenario can perhaps be described as AMP being generated by a Shank2/PDE complex bound to CFTR’s PDZ domain. PDE degrades cAMP to AMP, increasing the AMP/ATP ratio close to CFTR, and thus activating AMPK. The activated AMPK therefore inhibits CFTR and keeps the channel close under non-stimulated conditions.
Metformin treatment of diabetes mellitus increases the risk of pancreatitis in patients bearing the CFTR-mutation S573C
Metformin is an AMPK activator and is a drug used for the treatment of diabetes type II. Lactic acidosis is a common secondary complication of metformin therapy, especially in patients with renal dysfunction, alcohol abuse, or liver disease. Patients with renal failure have been reported to develop the pancreatitis after metformin therapy. We examined the effects of metformin treatment on a pancreatitis-related S573C-CFTR mutation. The results demonstrate a slight but significant reduction of S573C-CFTR whole cell currents that are further inhibited by metformin. On the other hand, metformin treatment of wtCFTR does not affect whole cell current induced by cAMP. These data suggest that the S573C mutation increases the sensitivity towards AMPK, However in vitro phosphorylation experiments reveal the same pattern of AMPK phosphorylation in wt and S573A-CFTR. Because lactic acidosis has been found during metformin therapy, and because CFTR is essential to control the pH balance in the pancreas, we challenged wt and S573C CFTR expressing oocytes by exposing them to acidic pH. The results demonstrate that intracellular acidificaiton reduces activation of wtCFTR, but almost completely abolishes Cl- currents produced by S573C-CFTR.
Taken together these data imply that patients carrying the S573C mutation have only a slight defect in CFTR Cl- currents. However, under metformin treatment, the Cl- transport in patients carrying the S573C mutation is largely reduced. Thus S573C-carrier have a higher risk in developing a pancreatitis after metformin therapy.
CFTR induces acid sensing and H+ activated Cl- transport
In the last section of the present thesis we identified a novel role of CFTR for detection of the extracellular proton concentration and regulation of the Ca2+ activated Cl- current. In wtCFTR expressing Xenopus oocytes, we observed a Ca2+ activated Cl- current after exposure of the oocytes to extracellular acidic pH. This current was strongly outwardly rectifying, sensitive to DIDS and NPPB, and required intracellular Ca2+ for the activation. We hypothesize that CFTR translocate H+-receptors to the plasma membrane and extracellular protons binding to these receptors induces an increase in intracellular [Ca2+]. We speculate that CFTR-dependent H+-sensing may be essential for bone metabolism, since CFTR is expressed in bone cells and because CF-patients suffer from osteoporosis.
Translation of the abstract (German)
Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) ist ein cAMP-abhängiger Cl--Kanal, der in der apikalen Membran von Epithelzellen exprimiert wird. CFTR spielt eine essentielle Rolle in der Elektrolyt- und Wasser-Homöostase. Mutationen im CFTR-Protein verursachen die Erkrankung Mukoviszidose (Cystische Fibrose), eine tödlich Erbkrankheit, die vor allem bei Kaukasiern auftritt. CFTR ...
Translation of the abstract (German)
Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) ist ein cAMP-abhängiger Cl--Kanal, der in der apikalen Membran von Epithelzellen exprimiert wird. CFTR spielt eine essentielle Rolle in der Elektrolyt- und Wasser-Homöostase. Mutationen im CFTR-Protein verursachen die Erkrankung Mukoviszidose (Cystische Fibrose), eine tödlich Erbkrankheit, die vor allem bei Kaukasiern auftritt. CFTR fungiert als Cl--Kanal, reguliert aber auch andere Ionenkanäle und Transporter. Obwohl CFTR seit mehr als 20 Jahren untersucht wird, bleiben viele Fragen bezüglich seiner Funktionen offen. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Funktionen von CFTR untersucht, die zu einem besseren Verständnis der Rolle von CFTR in Epithelzellen führen sollten: Die Regulation von CFTR durch die Adenosinmonophosphat-abhängige Kinase (AMPK) in vivo und in vitro, die Rolle der CFTR- Mutation S573C für die Entwicklung einer Pankreatitis, sowie die neuartige Funktion von CFTR als Sensor der extrazellulären Protonenkonzentration und Regulator der Ca2+ abhängigen Cl--Leitfähigkeit (CaCC).
Regulation von CFTR durch AMPK in vivo
Die Rolle der AMPK für den epithelialen Cl- -Transport wurde in vivo mit Hilfe von AMPK-α1 defizienten Mäusen untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen lassen auf eine wichtige Rolle von AMPK für die Regulation der Funktion von CFTR in vivo schließen. Ussingkammer-Experimente mit Präparaten des Kolons von AMPK-α1 defizienten Mäusen zeigten nach Aktivierung von CFTR durch cAMP einen erhöhten CFTR abhängigen Cl- -Strom. Im Gegensatz zu gesunden Geschwistertieren, war dieser cAMP-abhängige Cl- -Strom unempfindlich für Phenformin, einem Aktivator der AMPK. Zusätzlich bestätigten Messungen der rektalen Potenzialdifferenz (RPD) an AMPK-α1 defizienten Mäusen eine basale Erhöhung der RPD und eine verstärkte Aktivierung von CFTR durch cAMP gegenüber den Kontrolltieren. Dies sind die ersten Daten, die einen hemmenden Effekt der AMPK auf CFTR in vivo zeigen.
Mechanismus der Regulation von CFTR durch AMPK
Es wurde versucht die Phosphorylierungsstellen für AMPK im CFTR- Protein zu identifizieren und den Mechanismus der Regulation von CFTR durch AMPK in vitro zu untersuchen. Hierzu wurde die Methode der Expression in Xenopus laevis Oozyten verwendet. In diesem System können verschiedene CFTR-Mutationen exprimiert und der CFTR abhängige Cl- -Strom mit Hilfe der Spannungsklemme untersucht werden. Im Gegensatz zu den früheren Beobachtungen konnte gezeigt werden, dass die Aminosäuren S737 und S768 in der R-Domäne von CFTR von AMPK und nicht von der Proteinkinase A (PKA) phosphoryliert werden. Mutationen dieser Serine zu Alanin führte zur einer basalen Erhöhung des CFTR- Stroms im nichtstimulierten Zustand. Aktivierung von CFTR durch die PKA führte zu einem 4- fach größeren CFTR Strom. Dieser Strom konnte weder durch den AMPK-Inhibitor Phenformin noch durch den AMPK-Aktivator Compount C beeinflusst werden. Zusammenfassend zeigten diese Experimente, dass AMPK durch Phosporylierung von S737 und S768 die Ruheaktivität und PKA-abhängige Aktivierung von CFTR inhibiert.
Weiterhin wurde gezeigt, dass die α-Untereinheit von AMPK mit dem C-Terminus von CFTR interagiert. Daher kann eine lokale Regulation von CFTR durch die AMPK vermutet werden, unabhängig von dem gesamtzellulären AMP/ATP Verhältnis. Aus den Ergebnissen lässt sich folgendes Modell ableiten: AMP wird lokal vom Shank2/PDE Komplex gebildet. Dieser Komplex ist mit CFTR über eine PDZ- Interaktionsdomäne assoziiert. Die lokale AMP Konzentration führt zur Aktivierung der AMPK, die ebenfalls am C-Terminus von CFTR bindet. Die Aktivierung der CFTR-nahen AMPK hält den CFTR-Kanal unter Ruhebedingungen geschlossen.
Metformin Behandlung erhöht das Risiko einer Pankreatitis bei CF Patienten
Metformin ist ein Aktivator der AMPK und wird zur Behandlung von Diabetes mellitus Typ II eingesetzt. Die Laktatazidose ist eine häufige sekundäre Komplikation der Metformin-Therapie, insbesondere bei Patienten mit Nierenfunktionsstörung, Alkoholmissbrauch oder Lebererkrankungen. Auch wurde von Patienten mit Nierenversagen berichtet, bei denen sich eine Pankreatitis nach Metformin-Therapie entwickelte. Dieser gab Anlass, die Wirkung von Metformin auf die Funktion von CFTR mit der Mutation S573C zu untersuchen, die eine Pankreatitis auslösen kann. Während der cAMP aktivierte Cl--Strom des Wildtyp-CFTR von Metformin nicht gehemmt wird, ist der cAMP aktivierte Cl--Strom der CFTR Mutante S573C reduziert und durch Metformin hemmbar. Das Phosporylierungsmuster von wtCFTR und S573C-CFTR war dabei nicht verändert. Intrazelluläre Ansäuerung, z.B. durch eine Laktatazidose, führte ebenfalls zu geringer Hemmung von wtCFTR, aber zu fast vollständiger Inhibition von S573C-CFTR. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass bei Patienten mit der CFTR Mutation S573C die verringerte Aktivierung des CFTR Cl--Stroms durch cAMP funktionell ausreichend ist. Während einer Metformin-Therapie besteht jedoch die Gefahr einer kritischen Hemmung von S573-CFTR, u. a. im Pankreas, was zu einer Pankreatitis führen kann.
CFTR ermöglicht die Messung einer extrazellulären Azidose und reguliert Ca2+ aktivierte Cl- Kanäle
Im letzten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurden Hinweise gefunden für eine neue Rolle von CFTR bei der Messung der extrazellulären Protonenkonzentration. In Xenopus Oozyten konnte gezeigt werden, dass die Expression von CFTR notwendig ist, um über eine extrazelluläre Ansäuerung den endogenen Ca2+ aktivierten Cl- Kanal (CaCC) zu aktivieren. Dieser Strom ist deutlich auswärts gleichrichtend und wird durch DIDS und NPPB inhibiert. In der Abwesenheit von intaktem CFTR wird dieser Strom nicht aktiviert. Die Expression von CFTR könnte zu einer Translokalisation eines H+- Rezeptors in die Oozytenmembran führen. Bindung von extrazellulären Protonen aktiviert die Phospholipase C und führt zum Anstieg der intrazellulären H+-Konzentration, was CaCC aktiviert. Die physiologische Bedeutung der CFTR induzierten Protonenempfindlichkeit und Aktivierung von CaCC ist unklar. Die CFTR abhängige Expression eines H+- Rezeptors könnte für den Knochenmetabolismus und die Mineralisierung eine wichtige physiologische Rolle spielen. Osteoporose ist eine bekannte Komplikation der Mukoviszidose. Es ist bekannt, dass die Funktion von Osteoblasten und Osteoklasten von der extrazellulären Protonenkonzentration bestimmt wird und Kochenzellen CFTR exprimieren. Es ist daher möglich, dass bei Mukoviszidose eine Dysfunktion der Protonenmessung vorliegt, was zur Osteoporose führen könnte.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 06:54
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