Rademacher, Svenja
(2012)
EGG CELL 1 function and stability during double fertilization in Arabidopsis thaliana.
PhD, Universität Regensburg.
Date of publication of this fulltext: 14 May 2012 09:20
Abstract (English)
During double fertilization of angiosperms, the two sperm cells are transported conjointly to the female gametophyte, where one sperm cell fuses with the egg cell and the other sperm cell with the central cell. These fusions have to take place in a controlled manner to avoid undesired gamete fusion events and prevent polyspermy. Only little is known about gamete recognition and coordination of ...
Abstract (English)
During double fertilization of angiosperms, the two sperm cells are transported conjointly to the female gametophyte, where one sperm cell fuses with the egg cell and the other sperm cell with the central cell. These fusions have to take place in a controlled manner to avoid undesired gamete fusion events and prevent polyspermy. Only little is known about gamete recognition and coordination of gamete fusion in plants. The aim of this work was to characterize the function of the Arabidopsis egg cell-expressed EGG CELL 1 (EC1) gene family during gamete recognition and to identify putative interaction partners. The EC1 gene family comprises five members that encode cysteine-rich proteins, which are secreted from the egg cell during fertilization. Triple knockout mutants were additionally transformed with an RNAi construct targeting the remaining two genes. In these plants (ec1+/-) the fusion of the sperm cells with the female gametes was impaired resulting in a reduced seed set.
Detailed analyses of ec1+/- plants showed that in 45% of the ovules of ec1+/- plants sperm cells did not fuse with the female gametes and that non-fused sperm cells were always observed as pairs, which indicated that EC1 might function in sperm cell separation. This hypothesis was supported by the observation that single sperm cells of mutant pollen seemed to be able to fuse in ec1 ovules. With the aim to identify interaction partners of EC1, a pollen cDNA library was screened using a yeast-two-hybrid approach. Two putative interactors were found: (i) a protein containing two ubiqutin-like (UBL) domains (UbDKγ3), which is probably involved in substrate delivery to the 26S proteasome and (ii) a regulatory subunit of the Phosphatase 2A (PP2A B’θ). The putative interaction with a PP2A subunit and predicted phosphorylation sites at the C-terminus of EC1 indicated that phosphorylation might play a role in EC1. The transient expression of a phospho-mimicking variant of EC1 fused to eGFP in N. benthamiana leaves was more stable, i.e. showed fluorescence, compared to the wild type form of EC1. Moreover, a proteasome inhibitor experiment with plants expressing EC1.1 fused to eGFP under control of the 35S promoter suggested that misexpressed EC1 is rapidly degraded via the ubiquitin-proteasome pathway. Based on these findings, it was hypothesized that the pollen tube delivers the regulatory subunit of PP2A, which triggers dephosphorylation of the secreted EC1 and thereby marks it for degradation. This was supported by the observation that misexpressed PP2A B’θ in the synergid cell partially phenocopied the ec1 phenotype.
This work shows that EC1 is essential during double fertilization probably for gamete recognition or sperm cell separation. After fertilization and in all other cells, EC1 is unstable, its degradation is highly regulated and any protein accumulation is avoided.
Translation of the abstract (German)
Während der Doppelten Befruchtung bei Angiospermen werden die zwei Spermazellen als Einheit zum weiblichen Gametophyten transportiert, wo eine der Spermazellen mit der Eizelle und die andere mit der Zentralzelle fusioniert. Diese Zellfusionen müssen kontrolliert ablaufen, um ungewollte Fusionen zu verhindern und um Polyspermie zu vermeiden. In Pflanzen ist nur wenig über Gametenerkennung und die ...
Translation of the abstract (German)
Während der Doppelten Befruchtung bei Angiospermen werden die zwei Spermazellen als Einheit zum weiblichen Gametophyten transportiert, wo eine der Spermazellen mit der Eizelle und die andere mit der Zentralzelle fusioniert. Diese Zellfusionen müssen kontrolliert ablaufen, um ungewollte Fusionen zu verhindern und um Polyspermie zu vermeiden. In Pflanzen ist nur wenig über Gametenerkennung und die Koordinierung der Gametenfusion bekannt. Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung der eizell-spezifisch exprimierten Genfamilie EGG CELL 1 (EC1) aus Arabidopsis während der Gameteninteraktion und die Identifizierung putativer Interaktionspartner. Die EC1 Genfamilie umfasst fünf Mitglieder, die cysteinreiche Proteine kodieren, welche während der Befruchtung von der Eizelle sekretiert werden. Dreifachmutanten wurden zusätzlich mit einem RNAi-Konstrukt transformiert, das gegen die übrigen zwei Gene gerichtet ist. In diesen Pflanzen (ec1+/-) war die Fusion der Spermazellen mit den weiblichen Gameten beeinträchtigt was sich in einem verringerten Samenansatz äußerte.
Detailierte Analysen der ec1+/- Pflanzen ergaben, dass in 45% der Samenanlagen die Spermazellen nicht mit den weiblichen Gameten fusionierten, und dass nicht-fusionierte Spermazellen immer als Paare beobachtet wurden. Dies deutete darauf hin, dass EC1 an der Trennung der Spermazellen beteiligt sein könnte. Diese Hypothese wurde durch die Beobachtung gestützt, dass einzelne Spermazellen einer Mutante in der Lage zu sein schienen mit einem der weiblichen Gameten in ec1 Samenanlagen zu fusionieren. Mit dem Ziel Interaktionspartner zu identifizieren, wurde ein Screen einer Pollenschlauch cDNA-Bank mittels Hefe-2-Hybrid System durchgeführt. Zwei putative Interaktionspartner wurden identifiziert: (i) ein Protein, das zwei Ubiquitin-ähnliche (UBL) Domänen enthält (UbDKγ3), welches vermutlich bei der Substratübergabe an das 26S Proteasom eine Rolle spielt und (ii) eine regulatorische Untereinheit der Phosphatase 2A (PP2A B’θ). Die mögliche Interaktion mit der PP2A Untereinheit und vorhergesagte Phosphorylierungsstellen am C-Terminus von EC1 deuteten darauf hin, dass Phosphorylierung eine Rolle bei EC1 spielen könnte. Die transiente Expression einer phospho-mimicking Variante von EC1 fusioniert mit eGFP war stabiler, d.h. zeigte Fluoreszenz, im Gegensatz zur Wildtypform von EC1. Desweiteren ließen Proteasom-Inhibitor Experimente mit Pflanzen, die EC1.1-eGFP unter Kontrolle des 35S Promotors exprimieren, darauf schließen, dass missexprimiertes EC1 rasch über den Ubiquitin-Proteasom-Weg abgebaut wird. Auf diesen Ergebnissen basierend wurde die Hypothese aufgestellt, dass der Pollenschlauch die regultorische Untereinheit B’θ der PP2A anliefert, welche dann die Dephosphorylierung des sekretierten EC1 auslöst und dieses dadurch gleichzeitig für den Abbau markiert. Dies wurde duch die Beobachtung bestätigt, dass Missexpression von PP2A B’θ in den Synergiden zu einem ec1-ähnlichen Phänotyp führte.
Diese Arbeit zeigt, dass EC1 während der Doppelten Befruchtung essentiell ist, vermutlich für die Gametenerkennung oder für die Trennung der Spermazellen. Nach Befruchtung oder in allen anderen Zellen ist EC1 instabil, der ist Abbau streng reguliert und jegliche Akkumulation von Protein wird verhindert.
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