Müller, Philipp
(2011)
Der Einfluss von TEGDMA und Koffein auf den Zellzyklus muriner Makrophagen.
PhD, Universität Regensburg.
Date of publication of this fulltext: 01 Jun 2011 08:48
Abstract (German)
Zahnmedizinisch eingesetzte Komposite können selbst nach der Polymerisation der Komponenten der organischen Matrix Restmonomere freisetzen, die nun in Zellen benachbarter Gewebe bioaktiv wirksam werden können. Zytotoxische und gentoxische Effekte in vitro wurden vielfach beschrieben. Die Darstellung molekularer biochemischer Wege der Zytotoxizität und der Gentoxizität dentaler Monomere hingegen ...
Abstract (German)
Zahnmedizinisch eingesetzte Komposite können selbst nach der Polymerisation der Komponenten der organischen Matrix Restmonomere freisetzen, die nun in Zellen benachbarter Gewebe bioaktiv wirksam werden können. Zytotoxische und gentoxische Effekte in vitro wurden vielfach beschrieben. Die Darstellung molekularer biochemischer Wege der Zytotoxizität und der Gentoxizität dentaler Monomere hingegen erscheint schwierig, ist aber in Bezug auf die Entwicklung vernünftiger Strategien der Therapie notwendig. Für Comonomere wie TEGDMA und HEMA wurden in der Vergangenheit die Verzögerung des Zellzyklus wahrscheinlich infolge gentoxischer Effekte in vitro beschrieben. Allerdings wurde dieser Effekt abhängig von der jeweiligen Zelllinie sowohl in der G1-Phase als auch in der G2-Phase des Zellzyklus beobachtet. Die Mechanismen der Verzögerung des Zellzyklus in G1 oder G2 durch Monomere sind jedoch nicht genau bekannt. Zum einen ist denkbar, dass TEGDMA direkt und kovalent mit nukleophilen Zentren von DNA-Basen reagiert, so dass als Folge von DNA-TEGDMA-crosslinks letztlich DNA-Doppelstrangbrüche einen G2-Arrest auslösen. Anderseits ist es auch möglich, dass TEGDMA über die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) oxidative DNA-Schäden verursacht und DNA-Einzelstrangbrüche eine Verzögerung des Zellzyklus in G1 bewirken. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit die Wirkung von TEGDMA auf den Zellzyklus mit derjenigen von Adriamycin und Mitomycin C vergleichend analysiert. Während Adriamycin den Zellzyklus überwiegend in der G1-Phase verzögert, wirkt das DNA-quervernetzende Mitomycin C in der G2-Phase. Außerdem wurde in diesen Experimenten Koffein verwendet, das die Aktivität von ATM (ataxia telangiectasia mutated), eine Proteinkinase, die DNA-Schäden erkennt, inhibiert und so einen Arrest des Zellzyklus in der G2-Phase überschreibt. Der Einfluss von TEGDMA, Adriamycin und Mitomycin C auf den Zellzyklus wurde anhand der DNA-Verteilung nach Färbung mit Propidiumjodid und anschließender FACS-Analyse bestimmt. Zusätzlich wurde die Zytotoxizität durch die Überlebensraten in behandelten Kulturen ermittelt, und ferner wurde die Vitalität dieser überlebenden Zellen nach der Färbung mit Trypanblau mit FACS charakterisiert. Sämtliche Experimente wurden mit RAW264.7 Mausmakrophagen durchgeführt, die als Modell zur Analyse der Reaktion des zellulären Immunsystems dienten.
Die Wirkung von TEGDMA (1mM) und Adriamycin (1µM) auf den Zellzyklus war ähnlich, aber sehr verschieden von der Wirkung von Mitomycin C (0,5 µg/ml). TEGDMA und Adriamycin verursachten eine Verzögerung des Zellzyklus in der G1-Phase, eine ähnlich toxische Dosis Mitomycin C wirkte hingegen in der G2-Phase. Koffein (0-1000 µM) alleine verzögerte den Zellzyklus überwiegend in der G1-Phase, veränderte jedoch den Effekt von TEGDMA und Adriamycin auf den Zellzyklus nicht. Geringe Konzentrationen von Koffein schienen die Wirkung von Mitomycin C auf G2 zu verstärken, während die höchste Koffeinkonzentration dieser Tendenz entgegenwirkte.
Die hier beobachteten Effekte wurden mit physiologisch wirksamen Konzentrationen der einzelnen Substanzen gemessen. So reduzierte 1 mM TEGDMA alleine die Zahl überlebender Zellen auf etwa 62% derjenigen unbehandelter Kontrollen, und mit Adriamycin und Mitomycin C sank die Zahl überlebender Zellen auf 87% und 70%. Die verschiedenen Koffeinkonzentrationen hatten keinen erkennbaren Einfluss auf die Zytotoxizität der Substanzen. TEGDMA reduzierte außerdem die Vitalität dieser überlebenden Zellen auf etwa 60%. Adriamycin wiederum war ähnlich zytotoxisch wie TEGDMA, allerdings führte 1mM Koffein hier zu einer auch statistisch signifikanten Steigerung der Zellvitalität. Die hier gewählte Konzentration von Mitomycin C (0,5 µg/ml) bewirkte die höchste Toxizität verglichen mit TEGDMA und Adriamycin, aber 1 mM Koffein wirkte diesem Effekt entgegen.
Die hier erzielten Ergebnisse zusammengenommen mit den Hinweisen auf eine oxidative Schädigung der DNA durch TEGDMA sowie die durch das Antioxidans N-Acetylcystein inhibierte Verzögerung des Zellzyklus durch TEGDMA legen einen indirekten Einfluss von TEGDMA auf den Zellzyklus über oxidativen Stress nahe. Die Untersuchung molekularer Pfade über die Bestandteile dentaler Werkstoffe wie beispielsweise TEGDMA die Physiologie von Zellen und Gewebe beeinflussen, ist weiterhin wichtig, um zukünftig Materialunverträglichkeiten zu vermeiden und so alternative Strategien der Behandlung zu entwickeln.
Translation of the abstract (English)
Composites used in dentistry can release monomeres even after polymerisation of the organic matrix. These possibly have bioactive effects in cells of neighbouring tissue. In vitro, genotoxic and cytotoxic effects have been described, but it seems difficult to outline the molecular and biochemical pathways of cytotoxicity and genotoxicity of dental monomers. Nevertheless, this outline is very ...
Translation of the abstract (English)
Composites used in dentistry can release monomeres even after polymerisation of the organic matrix. These possibly have bioactive effects in cells of neighbouring tissue. In vitro, genotoxic and cytotoxic effects have been described, but it seems difficult to outline the molecular and biochemical pathways of cytotoxicity and genotoxicity of dental monomers. Nevertheless, this outline is very important for the development of decent and intelligent therapies. In the past, it has been observed that in vitro comonomeres as TEGDMA and HEMA induce a delay of the cell cycle probably as a result of genotoxic effects. These effects though have been depicted in G1-phase as in G2-phase dependent on the cell line. The mechanisms of the arrest of cell cycle in G1 or G2 by monomeres are not exactly known. One theory is that TEGDMA could react directly and covalent with the nucleophilic centres of the DNA bases and that as a consequence of the DNA-TEGDMA-crosslinks the double helix ruptures and induces a G2 arrest. It is also possible that TEGDMA induces a G1 arrest by damaging DNA by reactive oxygen species and the result is a single strand break. Therefor, the effect of TEGDMA on cell cycle was analysed in comparison with the effects of Adriamycin and Mitomycin C. Adriamycin seems to arrest cell cycle in G1, while Mytomycin C arrests in G2 by cross-linking DNA.
Also, caffeine was applied in the experiences, as it is a substance that inhibits the protein kinase ATM (ataxia telangiectasia mutated) which detects DNA damages. Thereby, the arrest in G2 phase is canceled. The effects of TEGDMA, Adriamycin and Mitomycin C on cell cycle were shown by observing DNA distribution after propidium iodide staining and a following FACS analysis.
Additionally, cytotoxicity was investigated by survival rate in the treated cell cultures. The vitality of these surviving cells was characterized by trypan blue staining with FACS. For the experiences, RAW264.7 mouse macrophages were used as a model to analyse the reaction of the cellular immune system.
The effects of TEGDMA (1mM) and Adriamycin (1µM) on cell cycle were similar, but very different to the effect of Mitomycin C (0,5 µg/ml).
TEGDMA and Adriamycin caused an arrest of cell cycle in G1 phase, whereas a similar toxic dose of Mitomycin C would react in G 2 phase. Caffeine (0-1000 µM) would also retard the cycle predominantly in G1 phase, but wouldn’t change the effects of TEGDMA and Adriamycin. Low concentrations of caffeine seem to intensify the effect of Mitomycin C in G2 phase whereas highest concentrations would cause the opposite.
Physiologically effective concentrations were used to cause the observed effects. 1 mM TEGDMA reduces the number of surviving cells to 62%, Adriamycin and Mitomycin C to 87% respectively 70%. The caffeine concentrations didn’t have any recognisible effect on the cytotoxicity of the substances. TEGDMA also reduces the vitality of the surviving cells to about 60%.
On the other hand, Adriamycin had a similar toxicity as TEGDMA, but 1 mM caffeine would significantly augment cell vitality. With its concentration of 0,5 µg/ml Mitomycin C effectuated the highest toxicity compared to TEGDMA and Adriamycin, but 1 mM caffeine counteracted the effect.
A couple of facts suggest an indirect influence of TEGDMA on cell cycle by oxidative stress: First of all the results of these experiences together with the indication of an oxidative damage of DNA by TEGDMA and also the inhibition of the retarding of cell cycle (caused by TEGDMA) by the antioxidant n-acetylcysteine.
The exploration of the molecular pathways of the components of dental materials as TEGDMA that affect the physiology of cells and tissue is still very important to avoid incompatibility of materials and to develop alternative strategies for therapy.
Export bibliographical data
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
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| Date: | 1 June 2011 |
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| Referee: | Prof. Dr. Helmut Schweikl and PD Dr. Martin Rosentritt |
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| Date of exam: | 2 May 2011 |
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| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Zahnerhaltung und Parodontologie > Prof. Dr. rer. nat. Helmut Schweikl |
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| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
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| Keywords: | TEGDMA, Zellzyklusarrest, Koffein, Adriamycin, Mitomycin C, Komposite, Toxizität, Zellvitalität, Vitalität, Zellzyklus, Zahnmedizin, Comonomere, HEMA |
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| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
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| Status: | Published |
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| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
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| Created at the University of Regensburg: | Yes |
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| Item ID: | 21058 |
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