| License: Publishing license for publications including print on demand (8MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-230125
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.23012
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 19 December 2012 |
| Referee: | PD Dr. Michael Nevels and Prof. Dr. Christian Maihöfner |
| Date of exam: | 15 December 2011 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene |
| Keywords: | Zytomegalievirus, Immediate Early 1-Gen |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 23012 |
Abstract (German)
Das humane Zytomegalievirus (HCMV) gehört zur Subfamilie der β-Herpesviren und zeichnet sich unter anderem durch eine strikte Speziesspezifität und einen langsamen Replikationszyklus aus. Trotz allgemein hoher Prävalenz des Virus beschränken sich HCMV-bedingte Gesundheitsschäden hauptsächlich auf immunsupprimierte Patienten und intrauterin infizierte Feten nach Primärinfektion von Schwangeren. ...
Abstract (German)
Das humane Zytomegalievirus (HCMV) gehört zur Subfamilie der β-Herpesviren und zeichnet sich unter anderem durch eine strikte Speziesspezifität und einen langsamen Replikationszyklus aus. Trotz allgemein hoher Prävalenz des Virus beschränken sich HCMV-bedingte Gesundheitsschäden hauptsächlich auf immunsupprimierte Patienten und intrauterin infizierte Feten nach Primärinfektion von Schwangeren. Die vorhandenen Virustatika können wegen ihres ungünstigen Nebenwirkungsprofils und des Auftretens resistenter Virusstämme nicht immer erfolgreich eingesetzt werden, weshalb die Entwicklung neuer Konzepte zur antiviralen Prävention und Therapie eine wichtige Aufgabe darstellt. Hierfür sind das molekularbiologische Studium des Infektionszyklus und der Einfluss kritischer viraler Komponenten von elementarer Bedeutung.
Die viralen major immediate-early (MIE)-Proteine beeinflussen als Schlüsselregulatoren in der initialen Phase der Infektion in entscheidender Weise den weiteren Verlauf der HCMV-Replikation und Pathogenese. Das 72 kDa IE1-Protein (IE1) wird dabei als erstes virales Genprodukt nach Infektion synthetisiert. Es akkumuliert in großen Mengen im Kern der Wirtszelle und moduliert dort unter anderem die Chromatin-Struktur, die zelluläre und virale Genexpression sowie die Integrität subnukleärer Multiproteinkomplexe (PML [promyelocytic leukemia]-Körper).
Bisher beschriebene HCMV-Mutanten deuten auf eine wichtige, aber nicht essenzielle Rolle des IE1-Proteins für die Virusvermehrung in Zellkultur hin. Um die Konsequenzen des spezifischen Funktionsverlustes der viralen IE1-Genprodukte eindeutig zu klären, wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Typen von Mutationen sowohl in einem etablierten Laborstamm (Towne, TN), als auch in einem klinischen Primärisolat (fusion inducing factor x, FIX) in das IE1-spezifische Exon 4 der HCMV MIE-Transkriptionseinheit eingeführt. Einige davon führten über eine Exon 4-Substitution zum kompletten Verlust der Expression von IE1. Darüber hinaus ist eine genaue Kenntnis regulatorischer Proteindomänen innerhalb des IE1-Proteins für die systematische Manipulation einzelner Funktionen unabdingbar. Deshalb wurden zusätzlich, durch minimal invasiven Austausch von einem bis maximal drei Nukleotiden an relevanten Stellen des IE1-spezifischen Exon 4, diverse vermutete Protein-Motive gezielt ausgeschaltet. Zu diesem Zweck entstanden im ersten Schritt Transferplasmide mit der jeweiligen Mutation im Bereich der IE1-Sequenz, die im weiteren Verlauf mit Hilfe der neuartigen BAC (bacterial artificial chromosome)-Technologie, also über homologe Rekombination mit infektiösen HCMV-BACmiden in Escherichia coli, die Generierung IE1-mutierter HCMV-Genome ermöglichten. Diese wurden anschließend zur Rekonstitution von Viruspartikeln in permissive, primäre humane Fibroblasten transfiziert. Aus der erfolgreichen Produktion BACmid-abgeleiteter Viren konnte bereits geschlossen werden, dass die punktmutierten IE1-Genprodukte für die HCMV-Vermehrung in Zellkultur nicht absolut notwendig sind. Eine Rekonstitution der vollständig IE1-defizienten Mutanten war hingegen nicht möglich, wahrscheinlich aufgrund eines IE1-unabhängigen negativen Effekts eines transdominant wirksamen Exon 2/3-kodierten Proteins oder einer inhibitorischen Wirkung der im Austausch für das Exon 4 integrierten Genkassette.
Im nächsten Schritt zeigten detaillierte Replikationskinetiken in infizierten humanen Fibroblasten deutliche Unterschiede im Ausmaß der Vermehrungskapazität einzelner Virusmutanten auf. So zog die Störung des hochkonservierten zentralen Bereichs, einschließlich eines vermuteten Leucinzippermotivs, im IE1 des TN- und FIX-Stammes (Mutanten TN/FIX_L174P und TN/FIX_K192P) eine erheblich eingeschränkte Virusreplikation nach sich. Gleiches traf für C-terminal trunkierte IE1-Mutanten zu, denen charakteristische saure Domänen fehlten (Mutanten TN/FIX_A373Stopp und TN/FIX_E421Stopp). Dagegen spielte sowohl die Ausschaltung eines putativen Zinkfingermotivs (Mutanten TN/FIX_C279A) als auch der Verlust der Bindung an das SUMO (small ubiquitin like modifier)-1-Protein (Mutante TN/FIX_K450R) für eine effektive Virusvermehrung in Zellkultur keine Rolle. Für die Virusmutante G476_Stopp, bei der die am äußersten C-Terminus gelegene Chromatinbindedomäne des IE1-Proteins deletiert wurde, ergab sich für den FIX-Stamm eine Wildtyp-ähnliche, für den TN-Stamm jedoch eine leicht attenuierte Replikationskinetik, was Spekulationen über stammspezifische Unterschiede zulässt.
Desweiteren konnte mit Hilfe immunfluoreszenzmikroskopischer Kolokalisationsstudien bewiesen werden, dass keine der eingeführten Punktmutationen für eine Kolokalisation zwischen IE1 und PML-Körpern erforderlich ist. Die Ausschaltung der SUMOylierung, der Chromatinbindung sowie des putativen Zinkfingermotivs zeigte außerdem keinerlei Einfluss auf die IE1-vermittelte Auflösung der PML-Körper. Im Gegensatz dazu wurde gezeigt, dass die Auflösung der PML-Körper in strikter Abhängigkeit des vermuteten Leucinzippermotivs erfolgt und auch bei Verlust der sauren Domänen oder Störung des zentralen Bereichs im viralen Protein weitgehend eingeschränkt ist.
Schließlich wurde mit geeigneten Effektorplasmiden im Dual-Luciferase Reporter Assay nachgewiesen, dass die Transaktivierung verschiedener Promotoren durch IE1 deutlich abnimmt, wenn die Struktur des C-Terminus oder des vermuteten Leucinzippermotivs gestört ist. Die Transaktivatorkapazität des viralen Proteins war jedoch bei Verlust des putativen Zinkfingermotivs oder der SUMOylierung von IE1 unbeeinflusst.
Auffälligerweise waren sämtliche Mutanten mit deutlichem Wachstumsnachteil gegenüber dem Wildtyp-Virus auch in ihrer Fähigkeit zur Auflösung der PML-Körper und in ihren Transaktivierungseigenschaften beeinträchtigt. Diese Beobachtung bestätigt, dass die Zerstörung der potenziell antiviralen PML-Körper eine mögliche Erklärung für den attenuierten Phänotyp IE1-mutierter Viren darstellt.
Insgesamt verdeutlichen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass dem HCMV IE1-Protein eine wichtige Funktion im produktiven viralen Infektionszyklus zukommt, obwohl es, zumindest für die Virusvermehrung in Zellkultur, nicht absolut essenziell ist. Allerdings ist davon auszugehen, dass IE1-defiziente oder -mutierte Viren unter den stringenteren Bedingungen natürlicher HCMV-Infektionen des Menschen apathogen sind. In diesem Zusammenhang bieten sich IE1 und speziell einige der hier beschriebenen Sequenzmotive im IE1-spezifischen Exon 4 als potenzielle neue Zielstrukturen für antivirale Strategien an.
Translation of the abstract (English)
The human cytomegalovirus (HCMV) belongs to the betaherpesvirus subfamily which is strictly species-specific and characterized by a slow replication cycle. Although the prevalence is rather high, mainly immunosuppressed patients and intrauterinely infected fetuses after a pregnant woman’s primary infection are affected by manifest injuries. Due to their unfavourable side effects and the ...
Translation of the abstract (English)
The human cytomegalovirus (HCMV) belongs to the betaherpesvirus subfamily which is strictly species-specific and characterized by a slow replication cycle. Although the prevalence is rather high, mainly immunosuppressed patients and intrauterinely infected fetuses after a pregnant woman’s primary infection are affected by manifest injuries. Due to their unfavourable side effects and the development of drug resistance, available antiviral drugs could not always be applied successfully. Therefore, new concepts for prophylaxis and antiviral treatment are essential. In this context, molecular studies concerning the lytic cycle and the impact of viral components are mandatory.
The viral major immediate-early (MIE)-proteins are in the initial phase of the infection decisive key regulators for HCMV replication and pathogenesis. The 72-kDa immediate-early 1 protein (IE1-72kDa) is the first viral gene to be expressed following the infection. It accumulates in large quantities in the nucleus of the host cell and modulates, inter alia, chromatin structure, cellular and viral gene expression and the integrity of subnuclear multi-protein complexes called promyelocytic leukaemia (PML) bodies. Already described mutant HCMV-viruses indicate an important, but not essential role of IE1-72kDa for viral growth in cell culture. To examine the effect of the specific loss of IE1-72kDa, we introduced in this work different types of mutations in the IE1-specific exon 4 sequence of the MIE transcriptional unit of HCMV, both in a laboratory-adapted strain (Towne, TN) and in a clinical isolate (fusion inducing factor x, FIX). Due to exon 4 substitution, some of them resulted in a complete loss of IE1 expression.
In addition, for systematic manipulation of individual functions, a detailed knowledge of regulatory domains within IE1-72kDa is indispensable. Therefore, we eliminated suspected structural motives for the protein function via minimally invasive change of one up to three nucleotides at relevant positions within the IE1-specific exon 4 sequence.
For this purpose, first of all we created transfer plasmids containing the respective mutation within the IE1 sequence. In further steps, the generation of HCMV genomes with mutations in the IE1 sequence was achieved by homologous recombination with infectious HCMV bacterial artificial chromosome (BAC) plasmids in Escherichia coli using the novel BAC technology. After that, for reconstitution of viruses, the recombinant HCMV BAC plasmids were transfected into permissive primary human fibroblasts. Since viral growth was successfully achieved, we concluded that the gene products of the concerning point mutations are dispensable for HCMV growth in tissue culture. By contrast, reconstitution of the IE1-deficient mutant viruses was not possible, probably because of an IE1-independent negative impact of a transdominant acting protein encoded by exon 2/3 or due to an inhibitory effect of the integrated gene cassette serving for exon 4 substitution.
In the next step, detailed analysis of the replication kinetics in infected human fibroblasts showed distinct differences concerning the growth capacity of the individual mutant viruses. For example, disruption of the highly conserved central domain in the TN and FIX strain, including a suspected leucin cipper motif (TN/FIX_L174P und TN/FIX_K192P) resulted in a considerably impaired viral replication. The same applies to the c-terminal truncated IE1 virus mutants, lacking characteristic acidic domains (TN/FIX_A373Stopp und TN/FIX_E421Stopp). However, neither the disruption of the assumed zinc finger motif (TN/FIX_C279A) nor the loss of the binding capacity to SUMO (small ubiquitin like modifier)-1-protein (TN/FIX_K450R) had any observable effect during effective viral growth in cell culture. The viral mutant G476_Stopp is characterized by the deletion of the c-terminal chromatin tethering domain of IE1-72kDa. The referring mutant virus of the FIX strain showed wild-type-like behaviour, while the mutant virus of the TN strain showed a slightly attenuated growth. This prompts speculations about strain-specific differences.
Apart from that, by means of colocalization studies using immunofluorescence techniques we could demonstrate that none of the integrated point mutations is required for the colocalization between IE1-72kDa and PML bodies. The suppression of the SUMOylation and the disruption of the chromatin tethering domain or the putative zinc finger motif had no impact on the IE1-72kDa-mediated disruption of PML bodies. Nevertheless, the disruption of PML bodies strictly depends on the suspected leucin cipper motif and furthermore was extensively impaired following the loss of the acidic domains or disintegration of the central hydrophobic domain within the viral protein.
Finally, we demonstrated with appropriate effector plasmids by means of the Dual-Luciferase® Reporter (DLR™) Assay System that IE1-72kDa-mediated transactivation of different promoters considerably decreases following disruption of the c-terminal structure or the suspected leucin cipper motif. However, the transactivating capacity of the viral protein was not influenced after loss of the assumed zinc finger motif or the SUMOylation of IE1-72kDa.
Strikingly, the mutant viruses with considerable growth disadvantages compared to the wild-type virus were also impaired in their ability to disrupt PML bodies and in their transactivating capacity. This observation confirms that the disruption of the potential antiviral PML bodies could serve as a possible explanation for the attenuated phenotype of viruses with mutations in the IE1-72kDa protein.
Overall, the results of this work elucidate the key function of HCMV IE1-72kDa in the course of the productive viral infectious circle, although it is not essential, at least for viral growth in tissue culture. However, it must be assumed that IE1-deficient viruses or viruses with mutations within the IE1 gene sequence are apathogenic concerning the more stringent conditions of a HCMV infection in humans. In this context, IE1 and especially some of the described structural sequence motives within the IE1-specific exon 4 sequence provide possible new targets for antiviral strategies.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 05:32
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