| License: Publishing license for publications excluding print on demand (8MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-232337
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.23233
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 20 December 2012 |
| Referee: | Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer and Prof. Dr. Werner Kremer |
| Date of exam: | 19 December 2011 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Keywords: | NMR, Lipoproteine, Ultrazentrifugation, Elektronenmikroskopie, Extraktion, Lipide, Hochdruck |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 530 Physics 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 23233 |
Abstract (German)
Lipoproteine stehen als Risikofaktoren für Herz-Kreislauferkrankungen hoch im Fokus des medizinischen Interesses. Strukturelle Veränderungen in LDL können nach heutigem Kenntnisstand zur Ausbildung von Arteriosklerose führen, aber auch das Verhältnis von besonders kleinen HDL oder LDL im Vergleich zu den jeweils größeren Partikeln hat entscheidenden Einfluss auf das Risiko zu erkranken. Zum ...
Abstract (German)
Lipoproteine stehen als Risikofaktoren für Herz-Kreislauferkrankungen hoch im Fokus des medizinischen Interesses. Strukturelle Veränderungen in LDL können nach heutigem Kenntnisstand zur Ausbildung von Arteriosklerose führen, aber auch das Verhältnis von besonders kleinen HDL oder LDL im Vergleich zu den jeweils größeren Partikeln hat entscheidenden Einfluss auf das Risiko zu erkranken. Zum Verständnis der genauen Mechanismen sind Informationen über Aufbau und Zusammensetzung der Lipoproteine notwendig, welche noch nicht vollständig geklärt sind. Akkurate und effektive Analyseverfahren sind zudem unabdingbar und können zu geeigneten Präventionsmaßnahmen verwendet werden.
In dieser Arbeit wurden mit Hilfe der NMR-Spektroskopie als nicht invasive Methode neue Erkenntnisse über den Aufbau und die Zusammensetzung von Lipoproteinen erzielt. Detaillierte Untersuchungen von eindimensionalen NMR-Spektren führten zu einem besseren Verständnis der Kurvenform, wodurch auch erste Erkenntnisse über die Struktur von bovinen Lipoproteinen möglich waren. Des Weiteren wurden diverse Methoden zur Isolierung und Quantifizierung der Lipoproteinklassen analysiert und miteinander verglichen.
Ein großer Teilaspekt galt der Evaluierung und Optimierung von Quantifizierungsmethoden. Dazu wurden aus einer Serumprobe eines gesunden Spenders die gängigen Lipoproteinsubklassen und zwei Serumprotein-Fraktionen isoliert. Aliquots dieser Proben wurden zum einen NMR-spektroskopisch, aber auch über enzymatische Analysen zur Cholesterinbestimmung und elektronenmikroskopische Untersuchungen charakterisiert. Es wurde zudem eine Methode etabliert, mit der über einen einfachen Extraktionsschritt und die Messung eines kurzen NMR-Experiments eine quantitative Aussage über die gesamte Lipidverteilung in Serum und den Lipoproteinen erhalten wurde. Über Linearkombination von NMR-Spektren konnte aus den Einzelspektren wieder das ursprüngliche Serumspektrum simuliert werden, was zu einer relativen Verteilung der Lipoproteinklassen und Proteinanteile führte. Methodisch ähnlich wurde über die relativen Diffusionskoeffizienten der isolierten Proben das Diffusionsverhalten von Serum studiert, was ebenfalls zu einer Aussage über die relative Verteilung führte. Durch geeignete Kombination der einzelnen Analysen war letztendlich eine gesamte Beschreibung der Lipid- und Lipoprotein-Zusammensetzung, sowie die Angabe einer ungefähren Konzentration von LDL und HDL in Serum möglich.
Ein weiterer Teilaspekt galt den NMR-Studien derselben Proben unter dem Einfluss von unterschiedlichen Temperaturen und unter Hochdruck. Bei sämtlichen Bedingungen wurden T2 Messungen zur Mobilität der einzelnen zu den Spektren beitragenden Signale angefertigt, welche auf die Beweglichkeit einzelner Lipide in den Partikel schließen ließen. Dabei wurden bekannte Phasenübergänge sowohl im Inneren der Partikel als auch in der Membran erkannt, aber auch eine weitere strukturelle Änderung, die zu einem signifikanten Signalabfall der Methylengruppen bei hohem Druck führte. Anhand dieser Informationen konnten zusätzlich strukturelle Aussagen über die Beschaffenheit von bovinen Lipoproteinen gemacht werden. Sowohl bovines LDL als auch HDL zeigten weniger dicht gepackte Strukturen. Bovines LDL lag außerdem im Vergleich zu HDL in einer sehr einheitlichen Größe vor.
Ein besonderes Augenmerk galt ferner dem Vergleich der Ultrazentrifugation und der Gelfiltration als Trennmethode zur Isolierung von Lipoproteinklassen und -subklassen. Zum einen wurde vorab isoliertes HDL2 und HDL3 jeweils mittels Dichtegradienten-Ultrazentrifugation und Gelfiltration subfraktioniert und über Gelelektrophorese und NMR-Spektroskopie untersucht. Um äußere Einflüsse möglichst gering zu halten, wurden dazu Studien über die Wirkung der Konzentration und des pH Wertes auf die Spektrenform durchgeführt. Während der pH-Wert nur einen sehr geringen Effekt zeigte, konnten abhängig von der Konzentration der Probe chemische Verschiebungen und veränderte Diffusionseigenschaften beobachtet werden, so dass die Konzentrationen der HDL Subfraktionen vorsorglich aneinander angeglichen wurden. Es ließ sich schließlich anhand von Diffusionsmessungen zeigen, dass sowohl die molaren Massen als auch die hydrodynamischen Radien der Partikel bezüglich der Separationsmethode differierten und für gelfiltrationsgetrennte Proben auch deutlich kleinere Partikel gefunden wurden. Die chemische Verschiebung hingegen wies für diese Subfraktionen eine geringere Streuung auf als für solche, die mittels Dichtegradienten-Ultrazentrifugation separiert wurden.
Auch die präparative Isolierung von Lipoproteinen aus gesamtem Serum wurde durchgeführt und durch NMR-spektroskopische Messungen analysiert. Während mit der sequenziellen Ultrazentrifugation eine klare Lipoproteintrennung erreicht wurde, konnte eine Dichtegradienten-Ultrazentrifugation in einem Schritt weniger dichte Partikel nicht effektiv isolieren. Eine neu entwickelte Methode, die auf der Aneinanderreihung von bis zu fünf Gelfiltrations-Säulen beruht, konnte eine respektable Trennleistung erzielen, jedoch wurden leichte Verunreinigungen durch Lipoproteine anderer Größen detektiert.
Translation of the abstract (English)
Lipoproteins are of special medical interest as risk factors for coronary artery disease (CAD). According to today’s state of knowledge structural changes in LDL can result in the formation of atherosclerosis, but also the ratio of particularly small HDL or LDL in contrast to the larger particles are decisive risk factors. Understanding the precise mechanisms requires information about the ...
Translation of the abstract (English)
Lipoproteins are of special medical interest as risk factors for coronary artery disease (CAD). According to today’s state of knowledge structural changes in LDL can result in the formation of atherosclerosis, but also the ratio of particularly small HDL or LDL in contrast to the larger particles are decisive risk factors. Understanding the precise mechanisms requires information about the assembling and composition of the lipoproteins which are not fully clarified. Besides accurate and effective analytical procedures are indispensable and can be used for convenient prevention.
In this work new findings of the assembling and composition of lipoproteins using NMR spectroscopy as non-invasive method are described. Detailed examination of one-dimensional NMR spectra resulted in a better understanding of line shapes which gave rise to first insights into the structure of bovine lipoproteins as well. In addition miscellaneous isolation and quantification methods for lipoprotein classes have been analyzed and compared.
One aspect of this work was focused on evaluation and optimization of quantification methods. For this purpose the common lipoprotein classes and two representative protein fractions have been isolated out of serum of a healthy donor. Different aliquots of this specimen were characterized using NMR spectroscopy, but also enzymatic analysis to determine cholesterol concentrations and electron microscopy. Besides established a method was established that resulted in quantitative information about the whole lipid distribution within serum and the lipoproteins requiring only one simple extraction step and the measurement of a short NMR experiment. Linear combination techniques were utilized to simulate the original NMR spectra from their individual spectra which resulted in a relative distribution of the lipoprotein classes and protein rates. A similar method was employed to study the diffusion behavior of serum due to the isolated samples’ relative diffusion coefficients which also resulted in a relative distribution. An adequate combination of the individual analyses finally caused a complete description of the lipid and lipoprotein composition in serum as well as an approximate concentration of LDL and HDL.
One further aspect involved the NMR studies of the same samples under the influence of different temperatures and high pressure. During all conditions T2 time measurements were performed to explore the mobility of contributing signals of the spectra which gave information about the flexibility of the various lipids within the particle. Well-known phase transitions in the particle core as well as in the outer membrane were identified but also further structural changes which resulted in a significant decay of the signal intensity of the methyl groups under high pressure. This information concluded in structural predication of bovine lipoproteins. Both LDL and HDL showed less tight packed structures. Furthermore bovine LDL was found to consist in homogenous sizes compared to HDL.
Special attention was paid to the comparison of ultracentrifugation and gel filtration as separation methods for the isolation of lipoprotein classes and subclasses. Previously isolated HDL2 and HDL3 were divided into subclasses using density gradient ultracentrifugation and gel filtration and analyzed by gel electrophoresis and NMR spectroscopy. To diminish external effects concentration and pH studies and their influence on spectra shape were performed. While different pH values showed only slight spectra changes, the concentration of a sample resulted in alternating diffusion properties. That is why the concentrations of the HDL subfractions were adjusted to one another as a precaution. Diffusion weighted NMR spectra demonstrated that molar masses as well as hydrodynamic radii of the particles differed between specimens isolated by the varied separation methods. Gel filtration even resulted in smaller particle sizes. Chemical shift variations on the other hand showed lower distribution considering these samples than those separated by density gradient ultracentrifugation.
The preparative isolation of lipoproteins out of whole serum was accomplished and analyzed by NMR spectroscopy as well. While sequential ultracentrifugation is able to separate clearly between the lipoproteins, there was no effective isolation of the lipoproteins of lower density using a one step density gradient ultracentrifugation. A newly developed method based on a sequence of five gel filtration columns in a row resulted in a respectable separating capacity though small amounts of lipoprotein contamination of different sizes could be found.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 15:25
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