| License: Publishing license for publications excluding print on demand (60MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-237954
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.23795
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 11 April 2013 |
| Referee: | Prof. Dr. Burkhard König |
| Date of exam: | 5 April 2012 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Organische Chemie > Lehrstuhl Prof. Dr. Burkhard König |
| Keywords: | tattoo, ingredients, carbon black, UVA, laser |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 23795 |
Abstract (English)
Tattooing is a worldwide phenomenon that exists since the early beginnings of our modern civilization. As part of human culture, this art of body decoration has reached significantly popularity, especially among young people under 30 years of age. In the past, inorganic metal salts containing chromium, cobalt, manganese, or mercury has been used in tattoo colorants. Today, tattoo inks are ...
Abstract (English)
Tattooing is a worldwide phenomenon that exists since the early beginnings of our modern civilization. As part of human culture, this art of body decoration has reached significantly popularity, especially among young people under 30 years of age. In the past, inorganic metal salts containing chromium, cobalt, manganese, or mercury has been used in tattoo colorants. Today, tattoo inks are mixtures of many components including precursors and by-products of pigment synthesis as well as various diluents for pigment suspension, whereas the actual chemical composition may vary for different ink products.
Millions of people in the western world have at least one tattoo and 60 % predominately contain black color. Actually, these inks are manufactured for other intended uses like printing, painting cars and coloring consumer products. Up to now, there is no legal requirement or regulation for listing ingredients on the labeling of tattoo inks and they may not have an established history for safe use in tattooing. In Germany, a first tattoo regulation appeared in 2009; it interdicts the use of azo pigments that can be cleaved to hazardous aromatic amines.
Despite the high number of individuals with black tattoos, we mainly focused on the chemical analysis of black tattoo inks. Since black inks are produced by imperfect combustion, they mainly consist of Carbon Black. It is, therefore, unsurprising that such black inks contain high amounts of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) and phenol.
With regard on the process of tattooing, pigment suspension is initially punctured into the dermis with vibrating tiny solid needles (tattoo machines). Some of the deposited ink particles may be recognized by macrophages as foreign bodies and carried from the site of the tattoo via the lymphatic system. Colorant that remains in the dermis represents the permanence, which is usually associated with tattoos. This procedure has been also associated with various types of cutaneous eruptions and different incidences of adverse reactions. In case of black tattoo inks, PAH and other substances can be introduced into skin, which might be responsible for health problems associated with tattoos, but up to now, the intrinsic chemical trigger is unknown.
To estimate the risk of any health problems of tattooing, the ingredients used and their concentration must be determined in both, ink suspension and in the skin and the human body. This has not been performed so far and was now firstly investigated by our research group.
In a previous study, we established an extraction procedure for determination and quantification of 20 different PAH in various commercial available black tattoo suspensions using liquid chromatography detection (HPLC – DAD). We detected total concentrations of PAH in the different inks ranging from 0.14 to 201 μg/g. Even benz[a]pyrene, a known carcinogen, was found in four ink samples at a mean concentration of 0.3 ± 0.2 μg/g. Regarding auxiliary ingredients, we investigated black tattoo inks in more detail by using GC – MS analysis to identify potential irritants or allergens, which might have the potential to be harmful for humans (chapter 1). We found the substances hexachlorobutadiene (HCBD), hexamethylenetetramine (HET), dibenzofuran (DF), dibutyl phthalate (DBP), 9-Fluorenone (9F), and benzophenone (BP), which are classified as (possible) genotoxic (HCBD, HET, DBP, BP), teratogenic (DBP) or as a possible human carcinogen (group C, HCBD). GC analysis and NIST database revealed the presence of other substances in the black inks, which were detected qualitatively, beneath 1,6-hexandiole, oleamide, 7-hexyl-2-oxepanone, propylene glycol, carbitol cellosolve and others. Many of the inks contain more than one ingredient at the same time, thus, the described health problems are more likely to be caused by some of the ingredients listed in this investigation, whereas the listing might be still incomplete.
To elucidate the role of PAH in skin, the concentration of PAH or phenol in tattooed skin should be determined (chapter 2). We established an extraction method to recover PAH quantitatively from digested human skin. The extraction of phenol as well as 20 PAH was accomplished using recovery experiments and HPLC – DAD technology. PAH and phenol could be almost completely recovered from digested human skin with recovery rates of 96 to 99 %. Even the very volatile smaller aromatic two- and three-ring structures like naphthalene, acenaphthene, and acenaphthylene were successfully extracted using a combined vortex and ultrasonic procedure and a keeper compound. The presence of Carbon Black in the digested skin did not affect the recovery rate.
The use of the established procedure should now allow a quantitative extraction of PAH from tattooed skin specimens. (chapter 3). Sixteen tattooed human skin specimens and related locoregional lymph nodes were digested and tested for 20 different PAH. The amount of these substances was quantified by using HPLC – DAD technology. PAH were found in twelve of the sixteen tattoos and in eleven locoregional lymph nodes. The PAH concentration ranged from 0.07 – 0.57 µg/cm2 in the tattooed skin and 0.05 – 11.75 µg/g in the lymph nodes. Our results provide evidence that PAH can be found in tattooed skin months or years after tattooing. In addition, Carbon Black obviously transported the PAH to the locoregional lymph nodes.
Since all investigated specimens contained black color, for the first time, we were able to establish a spectro-photometrical detection method for the quantitative recovery of Carbon Black nanoparticles from tattooed human skin samples and the related locoregional lymph nodes (chapter 4). In sixteen investigated tattooed human skin specimens, the overall mean amount of Carbon Black was 110.8 ± 48.3 µg/cm2. In a preliminary tattooing experiment using pig skin, a mean CB concentration of 517.2 ± 198.3 µg/cm2 was punctured into skin. Therefore, in large part (> 80%), tattoo ink particles are being transported from the site of the tattoo via lymphatic system and frequently found in the lymph nodes. The amount of CB in related sixteen locoregional lymph nodes was in the range of 0.11 mg/g up to 17.0 mg/g. Since Carbon Black is already listed as possible carcinogenic to humans (group 2 B), there is no legal regulation on black tattoo inks so far.
Sunlight exposure to people with black tattoos might pose another risk and affect human skin integrity (chapter 5). It is known, that some of PAH previously detected in black tattoo inks can absorb UV radiation and generate reactive oxygen species (ROS), such as singlet oxygen (1O2). We were able to demonstrate that upon UVA irradiation, thirteen of 21 investigated environmental pollutants generate photo – mediated decomposition products: formation of epoxides was detected in all cases except fluoranthene. Oxygen – free working conditions could show, that the oxidation of PAH is clearly mediated by 1O2 generation. In vitro conditions showed already cytotoxicity for parent PAH without irradiation. Upon UVA irradiation, the toxicity of PAH depended on the photoproduct.
As the incidence of tattooing continues to increase, so does the demand of people for tattoo removal (chapter 6). Tattoo inks contain a multitude of potentially immunogenic ingredients, e.g. PAH, that can be released or modified by laser treatment. We studied the interaction of black tattoo ink and intense laser pulses (Q-switched Nd:YAG) with regard to possible chemical alterations of PAH molecules and Carbon Black nanoparticles. Single PAH in solution may not be affected by laser treatment, since PAH do not absorb laser light at 532 nm. In the presence of Carbon Black nanoparticles, nearly all investigated 20 PAH decomposed in the range of 15.2% up to 99.9%. Photo-mediated decomposition products could not be clearly identified, since some of them are short-lived and could not be detected according to our analytical methods. With special concern to Carbon Black, we were able to detect a 90% disruption of ink nanoparticles by TEM and DLS. Up to present data, it remains unclear, whether decomposed nanomaterials after laser treatment are as cytotoxic, carcinogenic or mutagenic to human tissue as parental PAH and CB.
In light of these overall results, we urgently recommend regulation of tattoo inks so that only those inks without hazardous substances may be used. This could be started with a first step: substances that are not permitted for the use in cosmetics should be prohibited from being punctured into skin. Moreover, lack of knowledge should be removed by requiring complete listing of the ingredients as for cosmetics.
Translation of the abstract (German)
Tätowierungen existieren weltweit schon seit den frühen Anfängen moderner Zivilisation. Dabei gewann dieser Körperkult in heutiger Zeit vor allem bei den unter 30 Jährigen zunehmend an Popularität. Während früher Tätowierungsfarben auf Basis anorganische Metallsalze mit Chrom-, Cobalt-, Mangan- oder Quecksilber- Einschlüssen verwendet wurden, so bestehen sie heute aus einer Vielzahl ...
Translation of the abstract (German)
Tätowierungen existieren weltweit schon seit den frühen Anfängen moderner Zivilisation. Dabei gewann dieser Körperkult in heutiger Zeit vor allem bei den unter 30 Jährigen zunehmend an Popularität. Während früher Tätowierungsfarben auf Basis anorganische Metallsalze mit Chrom-, Cobalt-, Mangan- oder Quecksilber- Einschlüssen verwendet wurden, so bestehen sie heute aus einer Vielzahl verschiedener organischer Komponenten wie Azoverbindungen oder polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK).
In den USA sind bis zu 24 % der Bevölkerung tätowiert, in Deutschland sind es etwa 10 %. Eine kürzliche Studie im deutschsprachigen Raum hat ergeben dass etwa 60 % der rund 3400 Befragten ein hauptsächlich schwarzes Tattoo tragen. Die dafür verwendeten Farben werden eigentlich zum Lackieren von Konsumgütern wie z.B. in der Automobilindustrie, hergestellt, sie besitzen jedoch keine Zulassung für die Anwendung auf der Haut, eine gesetzliche Regulierung fehlt vollständig. Weder Herstellerangaben noch pharmakologische- oder toxikologische Informationen über die verwendeten Inhaltsstoffe werden deklariert. Seit 2009 gibt es in Deutschland immerhin schon eine Tätowiermittelverordnung, die den Gebrauch von Azoverbindungen, welche in karzinogene Amine gespalten werden können, untersagt.
Schwarze Tätowierungsfarben bestehen hauptsächlich aus Carbon Black. Dieser, als Ruß bekannte schwarze, pulverförmige Feststoff, entsteht vor allem durch unvollständige Verbrennungsprozesse, wodurch sich polyzyklische aromatische Verbindungen wie PAK oder auch Phenol als Nebenprodukte bilden. Betrachtet man den komplexen Tätowierungsvorgang nun näher, so werden Pigmente zusammen mit den jeweiligen Verunreinigungen in die Dermis eingestochen. Dass es bei Tätowierungen dann zu Problemen kommen kann, liegt zum einen an der mechanischen Traumatisierung und an Infektionen oder aber auch an der chemischen Zusammensetzung der Farben. In der kürzlich veröffentlichten Umfrage klagten 2/3 der Teilnehmer über Blutungen, Schwellungen und brennenden Schmerzen direkt nach dem Tätowierungsprozess, immer noch über 200 Teilnehmer gaben Juckreiz, Infiltration, Papeln und Ödeme als dauerhafte Probleme im Bereich des Tattoos an. In einer ersten Studie lag unser Fokus auf der chemischen Analyse von 20 PAK, die von der amerikanischen Umweltbehörde US-EPA und der Europäischen Kommission aufgrund Ihrer Toxizität und ihres mutagenen Potentials gelistet sind. Als wohl bekanntester Vertreter dieser gefährlichen Stoffgruppe sei hier das Benzo[a]Pyren genannt. Durch die Etablierung eines speziellen Extraktionsverfahrens konnten wir mittels HPLC Analyse PAK Konzentrationen in verschiedenen schwarzen Tätowierungsfarben im Bereich von 0.14 bis 201 µg/g nachweisen, darunter auch das erwähnte Karzinogen.
In einer erweiterten Studie wurden die Farben nun mittels Gaschromatographischer Analyse auf potentielle Allergene oder reizende Zusatz- und Inhaltsstoffe untersucht (Kapitel 1). Darunter fanden sich mit bis zu 710 µg/g erhebliche Mengen an zum Teil gentoxischen oder teratogenen Substanzen wie hexachlorbutadien (HCBD), hexamethylentetramin (HET), dibenzofuran (DF), dibutyl phthalat (DBP), 9-Fluorenon (9F) und benzophenon (BP). Qualitativ konnten noch einige weitere Stoffe wie 1,6-hexandiol, oleamid, propylen-glycol und andere detektiert werden. Oftmals wurden sogar mehrere dieser bedenklichen Inhaltsstoffe gleichzeitig in nur einem Farbpräparat nachgewiesen.
Um nun ein eventuelles Risiko für den menschlichen Organismus abschätzen zu können, ist es notwendig, die Konzentration an Tätowierungspigmenten in der Haut zu kennen (Kapitel 2). Das bereits etablierte Verfahren für die Extraktion von PAK aus schwarzen Tätowierungsfarben musste nun auf organisches Gewebe angepasst werden. Die vormals langen und aggressiven Extraktionsbedingungen (60 min Ultraschallbad, 60 °C) wurden zunächst auf die Extraktion aus exzidierter Schweinehaut angepasst. Durch Zusatz einer schwer-flüchtigen chemischen Verbindung, dem sog. „keeper“, konnte ein Verlust an leicht-flüchtigen PAK wie Naphthalin, Acenaphthen und Acenaphthylen verhindert werden. Mit diesem neuen Extraktionsschema (vortex und Ultraschallbad alternierend 1/5/1/5/1 min, RT) war es uns nun möglich, eine Recovery von 20 PAK und Phenol aus menschlichem Hautlysat mit 96 – 99 % zu erreichen.
Mit diesem etablierten Verfahren konnten nun 20 PAK aus real tätowierter Menschenhaut extrahiert werden (Kapitel 3). 16 verschiedene schwarze Hautpräparate wurden lysiert und analytisch mittels HPLC – DAD auf PAK untersucht. In 12 schwarzen Tattoos konnten wir PAK im Bereich von 0.07 – 0.57 µg/cm2 quantifizieren. Die PAK Phenanthren, Acenaphthen, Fluoren, Anthracen, Benzo[j]fluoranthen und Naphthalin seien hier als Hauptvertreter genannt. Da ein Teil der Pigmente in der Haut als Fremdkörper über das Lymphsystem abtransportiert wird, wurden ebenfalls die lokoregionären Lymphknoten untersucht. Elf davon enthielten PAK mit Konzentrationen im Bereich von 0.05 – 11.75 µg/g wobei größtenteils auch diejenigen PAK detektiert wurden welche zuvor in den jeweiligen Tätowierungen gefunden wurden.
Da sowohl alle 16 untersuchten Tätowierungen als auch die jeweiligen Lymphknoten schwarz gefärbt waren, wurde nun ein spektrophotometrisches Verfahren entwickelt, um den Gehalt an Carbon Black Nanopartikel in menschlichem Gewebe zu untersuchen (Kapitel 4). Carbon Black ist bereits als potentielles Karzinogen (Gruppe 2B) eingestuft. Exzidierte Schweinehaut wurde nun mit sowohl eigens hergestellter als auch mit originaler Tattoofarbe in verschiedenen Konzentrationen und verschiedenen Nadelformen und Nadelgrößen tätowiert. Je nach Größe der Pigmentkristalle, der verwendeten Konzentration der Suspension und des jeweiligen Tätowierungsprozesses belief sich der Gehalt an Carbon Black auf Werte zwischen 0.40 – 0.75 mg/cm2. In den untersuchten Hautpräparaten konnte das schwarze Pigment in einem Konzentrationsbereich von 21.1 ± 14.9 µg/cm2 bis zu 194.9 ± 21.1 µg/cm2 (im Mittel 110.8 ± 48.3 µg/cm2) nachgewiesen werden. Geht man nun davon aus, dass ein Tätowierer im Mittel 0.52 mg/cm2 an Carbon Black in die Haut einbringt so müsste im Laufe der Zeit etwa 80 % des schwarzen Pigments abtransportiert sein. Die spektrophotometrische Analyse der jeweiligen lokoregionären Lymphknoten lieferte eine Carbon Black Konzentration in Höhe von 0.11 mg/g bis zu 17.0 mg/g.
Von zunehmendem Interesse ist auch der Einfluss an UV – Strahlung auf die Tätowierungspigmente (Kapitel 5). Viele in den Tattoofarben vorkommenden PAK absorbieren UV – Licht und können reaktive Sauerstoffspezies (sog. ROS), vor allem den hochreaktiven Singulett Sauerstoff 1O2 erzeugen. In vitro Messungen hatten bereits in vorangegangenen Experimenten ergeben, dass die Quantenausbeute an Singulett Sauerstoff für PAK zwischen 46 % und 82 % liegen und damit zum Teil höher sind als für Photosensibilisatoren in der Photodynamischen Therapie (PDT). PAK könnten somit unter dem Sonnenlicht auf photodynamischem Wege den hochreaktiven Singulett Sauerstoff auch in der Haut erzeugen. Bei 13 aus 20 PAK konnten wir vor allem die Bildung von PAK – Epoxid – Derivaten analytisch mittels HPLC – MS und chemischer Reaktion mit n-butylamin nachweisen. Unter Sauerstoffausschluss konnte dann letztendlich auf die Generierung des hochreaktiven Singulett Sauerstoff 1O2 rückgeschlossen werden. Wie gefährlich diese Sauerstoff Spezies sein können, wird am enzymatisch gesteuerten Mechanismus von Benzo[a]Pyren im menschlichen Körper deutlich. Das entstehende, sog. „Ultimative Karzinogen“ kann mit der DNA reagieren und so deren Struktur verändern, was Zellteilung verhindern oder Mutationen begünstigen kann. Dieser Polyzyklus ist bereits auch für andere PAK, wie z.B. Dibenzo[a,l]Pyren, beschrieben, welches wir ebenfalls in den Tätowierungsfarben quantifizieren konnten.
Aus verschiedensten Gründen unterziehen sich viele Menschen einer Lasertherapie, um die Tätowierungen letztendlich wieder entfernen zu lassen (Kapitel 6). Die Interaktionen zwischen Laser Energie und schwarzen Tätowierungsfarben wurden nun näher untersucht. Während freie PAK bei Lasereinwirkung von 532 nm nicht absorbierten, zersetzten sie sich in Gegenwart von Carbon Black weitestgehend (15.2% bis 99.9%). Neben der Entstehung reaktiver Sauerstoff Spezies vermuten wir auch die Bildung von PAK-Sauerstoff-Derivaten, thermisch induziert durch die räumlich Nähe zwischen absorbierendem Carbon Black und PAK. Spektrophotometrisch konnte gezeigt werden, dass sich diese Carbon Black Nanopartikel mit einem Partikeldurchmesser von etwa 50 nm – 70 nm nach Lasereinwirkung auf etwa 7 nm reduzieren. Diese Nanopartikel werden dann vom Lymphsystem abtransportiert was weitere Untersuchungen vor allem aber in vivo Studien, erforderlich macht. Aufgrund extremer Kurzlebigkeit konnten jedoch weitere Zersetzungsprodukte mit unseren analytischen Methoden vorerst nicht detektiert werden.
Die letztendliche Toxizität und Karzinogenität der Tätowierungsfarben und deren Inhaltsstoffe sowie Licht-induzierten Spaltprodukten hängt unter anderem natürlich von deren Konzentration in der Haut ab. Angesichts der großen Zahl an tätowierten Menschen möchten wir mit unseren einschlägigen Ergebnissen die Gesetzgeber dringend dazu auffordern, einheitliche Regulierungen der Tätowierungsfarben zu veranlassen.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 15:26
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