| License: Publishing license for publications excluding print on demand (2MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-254798
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.25479
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 16 August 2012 |
| Referee: | Prof. Dr. Olaf Strauß |
| Date of exam: | 12 July 2012 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Augenheilkunde |
| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
| Keywords: | Bestrophin-1, endoplasmic reticulum, store-operated calcium entry |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 25479 |
Abstract (English)
Mutations in the BEST1 gene lead to a variety of retinal degenerations. To understand the function of the BEST1 gene product, bestrophin-1, represents the first step in the investigation of patho-mechanisms leading to BEST1-associated retinal degenerations. Bestrophin-1 is a protein expressed in the cells of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of epithelial cells in the outer retina ...
Abstract (English)
Mutations in the BEST1 gene lead to a variety of retinal degenerations. To understand the function of the BEST1 gene product, bestrophin-1, represents the first step in the investigation of patho-mechanisms leading to BEST1-associated retinal degenerations. Bestrophin-1 is a protein expressed in the cells of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of epithelial cells in the outer retina which closely interact with the photoreceptors. Thus, it is likely that mutant bestrophin-1 changes the RPE function which in turn leads to photoreceptor degeneration. So far the properties of bestrophin-1 were identified by functional analysis of over-expressed proteins. In these studies bestrophin-1 was identified as a Ca2+-dependent Cl channel in the plasma membrane. However, this result could not explain observations made in animal models for bestrophin-1 or cellular function analysis in relation to presence of endogenously expressed bestrophin-1. The few studies on the function of endogenously expressed bestrophin-1 indicated that it may have an intracellular function in relation to Ca2+signaling. The aim of the study was to investigate the function of endogenously expressed bestrophin-1 in mouse models and in a newly developed in vitro model of porcine RPE cells.
Since the retina of bestrophin-1 knock-out mice or Best+/Y227N knock-in mice showed no degeneration, the susceptibility of these retinae to light-damage at the threshold to light-damage was tested. Here, no differences between wild-type and transgenic mice were found. Also the ATP-dependent Ca2+-Signals in RPE cells from these mouse strains were not changed. In the porcine RPE cell model siRNA bestrophin-1 was investigated. Ca2+-signaling was ignited by induction of store-operated Ca2+-entry (SOCE). Pharmacological analysis and siRNA knock-down of Orai-1 expression reveled that SOCE was dependent on the activation of Orai-1 channels by stim-1 (stromal interacting molecule-1). Reduction of bestrophin-1 expression did not change the expression of stim-1 or orai-1 expression but reduced the SOCE amplitude. Measuring amplitude of Ca2+-release from intracellular Ca2+ stores in response to inhibition of sarcoplasmaic Ca2+-ATPase (SERCA) and quantification of the amount of Ca2+ releasable from ER Ca2+ stores revealed that after bestrophin-1 knock-down the amount of Ca2+ in these stores was strongly decreased. In addition to these functional data also the analysis of subcellular bestrophin-1 localization by means of immunocytochemistry or electron-microscopy revealed that bestrophin-1 is an intracellular protein which co-localizes with stim-1. However, bestrophin-1 and stim-1 did not physically interact.
In summary, we found that bestrophin-1 is likely an intracellular Cl channel in the membrane of cytosolic Ca2+ stores which are localized close to the basolateral membrane. As a Cl channel bestrophin-1 can Ca2+-dependently conduct the counter-ion for Ca2+ to accumulate Ca2+ in ER stores. The reduced Ca2+ amount in Ca2+-stores decreases the activation SOCE and therefore changes intracellular Ca2+ signaling which controls RPE function. With these conclusions we can open a new route to understand the chain of events leading to retinal degeneration in BEST1-associated diseases.
Translation of the abstract (German)
Mutationen im BEST1-Gen führen zu einer Vielfalt retinaler Degenerationen. Ein Verständnis der Funktion des BEST1-Genprodukts, Bestrophin-1, stellt den ersten Schritt in Untersuchungen zum Pathomechanismus BEST1-assoziierter Retinadegenerationen dar. Bestrophin-1-Protein ist im Retinalen Pigmentepithel, einem einschichtigen Epithelium der äußeren Retina, welches eng mit den Photorezeptoren ...
Translation of the abstract (German)
Mutationen im BEST1-Gen führen zu einer Vielfalt retinaler Degenerationen. Ein Verständnis der Funktion des BEST1-Genprodukts, Bestrophin-1, stellt den ersten Schritt in Untersuchungen zum Pathomechanismus BEST1-assoziierter Retinadegenerationen dar. Bestrophin-1-Protein ist im Retinalen Pigmentepithel, einem einschichtigen Epithelium der äußeren Retina, welches eng mit den Photorezeptoren interagiert, exprimiert. Somit ist es wahrscheinlich, dass Bestrophin-1 RPE-Funktionen verändert, welche dann zur Photorezeptordegeneration führen. Bisher wurden die Eigenschaften von Bestrophin-1 durch funktionelle Analysen überexprimierten Proteins untersucht. In diesen Arbeiten wurde Bestrophin-1 als Ca2+ abhängiger Cl-Kanal der Plasmamembran identifiziert. Allerdings konnte dieses Ergebnis nicht die Beobachtungen erklären, die in Tiermodellen für Bestrophin-1 oder zellulären Funktionsanalysen in Verbindung mit dem Vorhandensein endogen exprimierten Bestrophin-1 gemacht wurden. Die wenigen Studien zur Funktion von endogen exprimiertem Bestrophin-1 weisen darauf hin, dass es eine intrazelluläre Funktion in Verbindung mit Ca2+ Signalen besitzt. Ziel dieser Arbeit war, die Funktion von endogen exprimiertem Bestrophin-1 in Mausmodellen und in einem neu entwickelten in-vitro-Modell porciner RPE-Zellen zu untersuchen.
Nachdem die Retina von Bestrophin-1 knock-out Mäusen oder Best+/Y227N knock-in Mäusen keine Degenerationen zeigt, wurde die Empfindlichkeit dieser Retinae für Lichtschaden im Grenzbereich getestet. Hier wurden keine Unterschiede zwischen wildtyp und transgenen Mäusen gefunden. Auch waren ATP-abhängige Ca2+ Signale in den RPE-Zellen dieser Mäuse nicht verändert. Im Modell porciner RPE-Zellen wurde der siRNA-vermittelte knock-down von Bestrophin-1 untersucht. Dabei wurden durch Aktivierung von store-operated Ca2+-entry (SOCE) initierte Ca2+ Signale ausgewertet. Pharmakologische Analyse und siRNA knock-down der Orai-1 Expression zeigten, dass SOCE von der Aktivierung von Orai-1 Kanälen durch stim-1 (stromal interacting molecule-1) abhängig war. Die Reduktion der Bestrophin-1-Expression führte zu einer erniedrigten Amplitude von SOCE, bei unveränderter Expression von stim-1 oder Orai-1. Durch Messungen der Amplitude der Ca2+ Freisetzung aus intrazellulären Ca2+ Speichern nach Inhibition der sarcoplasmatischen Ca2+-ATPase (SERCA) und Quantifizierung der Menge an freigesetztem Ca2+ aus intrazellulären Speichern zeigte sich, dass nach Bestrophin-1 knock-down die Menge an Ca2+ in diesen Speichern stark reduziert war. Zusätzlich zu diesen funktionellen Daten weist auch die Analyse der subzellulären Lokalisation von Bestrophin-1 durch Immunozytochemie oder Elektronenmikroskopie darauf hin, dass Bestrophin-1 ein intrazelluläres Protein ist, was mit stim-1 ko-lokalisiert.
Zusammenfassend ist Bestrophin-1 wahrscheinlich ein intrazellulärer Cl-Kanal in der Membran cytosolischer Ca2+ Speicher, die in der Nähe der basolateralen Membran lokalisiert sind. Als ein Cl-Kanal kann Bestrophin-1 Ca2+ abhängig die Gegenionen zur Ca2+ Akkumulation in ER-Speichern liefern. Die niedrigere Ca2+ Menge in Ca2+ Speichern führt zu einer niedrigeren SOCE-Aktivität und verändert damit intrazelluläre Ca2+ Signalwege, welche RPE-Zellfunktionen kontrollieren. Mit diesem Ergebnis eröffnet sich ein neuer Weg im Verständnis der Mechanismen, die zur retinalen Degeneration in BEST1-assoziierten Erkrankungen führen.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 04:20
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