Entwicklung eines Plasmids zur Expression von SOCS-3 in Hepatozyten

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Bauer, Bernhard Josef

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Date of publication of this fulltext: 18 Sep 2012 06:05

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Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Date:	18 September 2012
Referee:	Prof. Dr. Stefan Fichtner-Feigl
Date of exam:	12 September 2012
Institutions:	Medicine > Lehrstuhl für Chirurgie
Keywords:	SOCS-3, STAT-3, IL-6
Dewey Decimal Classification:	600 Technology > 610 Medical sciences Medicine
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	25890

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Abstract (German)

Abstract (German)

Entzündungsvorgänge spielen eine sehr wichtige Rolle bei der Entstehung und der Aufrechterhaltung malignen Wachstums. Besonders IL-6 und seine Signalübertragung mittels der JAK-STAT-3 Kaskade sind in vielen Tumorentitäten dysreguliert. Der hierbei vermehrt aktivierte Transkriptionsfaktor STAT-3 nimmt eine Schlüsselrolle ein bei der
Vermittlung maligner Eigenschaften wie Apoptoseresistenz und gesteigerte Proliferation.
SOCS-3 ist ein natürlicher Inhibitor dieses Signalwegs. Eine Methylierung seiner
Genregion und damit eine verringerte Aktivität dieses Proteins konnte unter anderem
im hepatozellulären Karzinom nachgewiesen werden. Erhöhte SOCS-3 Konzentrationen
führen zu reduziertem Wachstum und verstärkter Apoptose von Tumorzellen.
Die vorliegende Promotion hat das Ziel, ein Plasmid mit leberzellspezifischer SOCS-3
Expression herzustellen und dessen Funktionalität in vitro nachzuweisen. Dies kann in Folge dazu dienen, die Funktion von SOCS-3 bei der Entstehung des HCC zu entschlüsseln und mögliche therapeutische Ansätze aufzuzeigen.
Das SOCS-3 Gen wurde mittels einer PCR vervielfältigt und dieser DNA Abschnitt in
einen CMV Promoter tragenden Vektor überführt. Die Vollständigkeit und Expression
von der Genregion und damit die Funktionalität des Plasmids konnte durch Gensequenzanalyse und Westernblot verifiziert werden. Der anschließende Austausch der Promoterregion führt zur Spezifität des Vektorproteins bezüglich Leberzellen, da nur in
diesen der Albumin Promoter aktiviert wird. Damit transfizierte HepG2 und Hepa 1-6 Zellen zeigen im Westernblot im Gegensatz zu nativen Zellen deutlich erhöhte SOCS-3 Proteinmengen.
Als Funktionsanalyse des modifizierten Vektors fungierten nach Stimulation mit IL-6
ein pSTAT-3 Westernblot und eine pSTAT-3 Bindungskapazitätsmessung. Eine nach Stimulation gemessene erniedrigte pSTAT-3 Proteinmenge und eine verringerte pSTAT-3 Bindungskapazität in mit dem hergestellten Plasmid transfizierten Zellen entsprechen der erwarteten Wirkung vermehrt vorliegenden SOCS-3, das als natürlicher Inhibitor
des JAK-STAT-3 Signalweges wirkt.
Die Wirkung von SOCS-3 über die molekulare Ebene hinaus konnte im Vergleich der DNA Synthese und damit der Proliferation der Zellen gezeigt werden. Das Wachstum mit dem SOCS-3 tragenden Vektor transfizierter Zellen nach IL-6 Stimulation ist im Vergleich zu nativen Zellen deutlich verringert. Der proliferative Effekt von IL-6 und dessen nachfolgendem Signalweg über STAT-3 kann durch vermehrte SOCS-3 Expression effektiv gehemmt werden.
Mit Vorliegen dieses Vektors können weiterführende in vivo Experimente durchgeführt werden, die die Rolle und den Einfluss von SOCS-3 auf Lebertumormodelle in Mäusen untersuchen. Dies trägt nicht nur zum Verständnis der Vorgänge auf molekularer Ebene jener malignen Erkrankung bei, sondern kann mögliche therapeutische Ansätze aufzeigen.

Translation of the abstract (English)

Inflammation is one of the main factors for developing and maintaining malignant growth. Especially IL-6 and its signalling pathway including the JAK-STAT-3 cascade are dysregulated in many tumor entities. Hereby the transcription factor STAT-3 plays a key role communicating malignant features like resistance to apoptosis and enhanced
proliferation. SOCS-3 is a natural inhibitor of this signalling pathway. Reduced activity of this protein by DNA methylation was found among others in hepatocellular carcinoma. In contrast increased SOCS-3 concentrations reduce growth and promote
apoptosis in cancer cells.
The goal of this study was to create a plasmid expressing SOCS-3 exclusively in liver cells and to prove its functionality in vitro. Subsequently this can help to clarify the
significance of SOCS-3 in the formation of the HCC and to identify possible therapies.
Using PCR the SOCS-3 gene was cloned and transfered to a CMV promoter carrying vector. The integrity and expression of the obtained DNA was verified by gene sequence analysis and westernblot. The following change of the promoter region lead to an exclusive
expression in liver cells, because solely those activate the albumin promoter. HepG2 and Hepa 1-6 cells transfected with this vector showed a significant elevation of the SOCS-3 protein compared to native cells.
After cell stimulation with IL-6 a pSTAT-3 westernblot and a pSTAT-3 binding capacity
analysis proved the functionality of the modified vector. Reduced amount of pSTAT-3 protein and binding capacity after stimulation in transfected cells containing the created plasmid correspond to the expected effect of increased SOCS-3 levels, which is a natural inhibitor of the JAK-STAT-3 signalling pathway.
The effect of SOCS-3 above the molecular level could be shown in the comparison of DNA synthesis and thus proliferation of cells. After stimulation with IL-6 growth of cells carrying the SOCS-3 vector was significantly reduced compared to native cells. The proliferative effect of IL-6 and its subsequent signalling pathway via STAT-3 could effectively be inhibited by an increased SOCS-3 expression.
With this vector further studies can be performed in order to examine the influence of SOCS-3 in liver tumor models in mice. This not only leads to a more detailled understanding of the molecular interactions of this malignancy but furthermore can identify possible therapies.

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