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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-274122
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 31 January 2013 |
| Referee: | Prof. Dr. Olaf Strauß |
| Date of exam: | 3 December 2012 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Augenheilkunde |
| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
| Keywords: | Retinal pigment epithelium, phagocytosis, ion channel |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 27412 |
Abstract (German)
In der äußeren Retina besteht eine enge funktionelle Interaktion zwischen retinalem Pigmentepithel (RPE) und Photorezeptoren. Eine wichtige Aufgabe des RPE ist hier die zirkadian regulierte Phagozytose der äußeren Segmente der Photorezeptoren, welche permanent erneuert werden. Ist diese empfindlich genau geregelte Interaktion beider Zellgruppen gestört, kann es zu schwerwiegenden Erkrankungen, ...
Abstract (German)
In der äußeren Retina besteht eine enge funktionelle Interaktion zwischen retinalem Pigmentepithel (RPE) und Photorezeptoren. Eine wichtige Aufgabe des RPE ist hier die zirkadian regulierte Phagozytose der äußeren Segmente der Photorezeptoren, welche permanent erneuert werden. Ist diese empfindlich genau geregelte Interaktion beider Zellgruppen gestört, kann es zu schwerwiegenden Erkrankungen, verbunden mit dem Verlust von Photorezeptoren, und damit zur Erblindung kommen. Einige für die Interaktion wichtige Rezeptoren und Moleküle sind bekannt. Die Regulation des Phagozytoseprozesses im RPE weiterführend nach dem Rezeptorkontakt ist jedoch nicht komplett geklärt. In der Arbeit sollte der Einfluss verschiedener Ionenkanäle auf die Regulation der Phagozytose überprüft werden. Zur Untersuchung dieses Ansatzes wurde ein in vitro Modellsystem etabliert, bei dem die Phagozytose in primären porcinen RPE Zellen, denen isolierte Außensegmente von Photorezeptoren zugefügt werden, untersucht wird. Hier konnte durch pharmakologische Blockierung gezeigt werden, dass L-Typ Ca2+ Kanäle und TRPV Kanäle durch Generierung von Ca2+ Signalen, welche für den Ablauf weiterer Signalkaskaden während des Phagozytoseprozesses benötigt werden, beteiligt sind. Bestrophin-1 interagiert direkt mit den β-Untereinheiten der Cav1.3 L-Typ Ca2+ Kanäle des RPE. Dabei führt die Interaktion mit dem Bestrophin-1 zur Hemmung der Ca2+ Kanalaktivität. Erkenntnisse zur subzellulären Lokalisation von endogenem Bestrophin-1 wurden mittels differentieller Zentrifugationen gewonnen. Hier fand sich Bestrophin-1 hauptsächlich in Fraktionen mit Anreicherungen intrazellulärer Membranproteine, was auf eine intrazelluläre Lokalisation von Bestrophin-1 hindeutet. Weiterhin konnte ein funktioneller Einfluss von Bestrophin-1 auf die Phagozytosefunktion über seine modulatorische Aktivität an Cav1.3 L-Typ Ca2+ Kanälen in vitro gezeigt werden. Der siRNA knock-down von Bestrophin-1 führte hier zu einer erhöhten Phagozytoserate, was einen aktivierenden Einfluss der L-Typ Kanäle auf die Phagozytose bestätigt. Im RPE ist eine direkte funktionelle Kopplung der Aktivität von spannungs- und Ca2+-aktivierten K+ Kanälen (BK) und der Aktivierung von L-Typ Ca2+ Kanälen über einen negativen feedback Kontrollmechanismus bekannt. Bei pharmakologischer Inhibition des BK K+ Kanals in Phagozytose in vitro Experimenten kommt es ebenfalls zu einer reduzierten Phagozytoseaktivität, was nahe legt, dass dieser direkte Antagonismus keine vordringliche Rolle für die Phagozytose-Regulation spielt.
Weiterführend wurde die Rolle des Cav1.3 Ca2+ Kanals in der Regulation der Phagozytose in vivo untersucht. Dazu standen ein knock-out Mausmodell für Cav1.3 und BK Kanal zur Verfügung. Da es sich bei der Phagozytose des RPEs um einen zirkadian regulierten Prozess handelt, wurden mittels immunhistochemischer Färbungen der Retina zu verschiedenen Tageszeiten die Anzahl der Phagosomen im RPE ermittelt, was dessen phagozytärer Aktivität entspricht. Es zeigte sich dabei im Cav1.3 Mausmodell ein Unterschied in der morgendlichen Peak-Aktivität, und über den Tagesverlauf hin findet sich eine höhere Anzahl von Phagosomen in den knock-out Tieren im Vergleich zu den wildtypen. Im zweiten Mausmodell, defizient für BK K+ Kanal, zeigte sich ein veränderter zirkadianer Rhythmus in der morgendlichen Peak Aktivität der Phagozytose und im Tagesverlauf eine geringere Phagozytoseaktivität. Weiterhin konnten an diesem Mausmodell strukturelle Veränderungen der Retina in Form von verkürzten Photorezeptoraußensegmenten festgestellt werden. Insgesamt unterstreichen die gewonnenen Daten eine Bedeutung der untersuchten Ionenkanäle für eine normale Regulation der Phagozytose des RPE. Fehlfunktionen der Kanäle könnten entscheidend für Erkrankungen des Menschen sein, die mit einer veränderten Phagozytose einhergehen.
Translation of the abstract (English)
The retinal pigment epithelium (RPE) is a close interaction partner of photoreceptors in the retina. Photoreceptors continuously renew their light sensitive outer segments in a process called disk shedding, in which they eliminate their most aged and destroyed tips once a day. The neighboring retinal pigment epithelium (RPE) is responsible for swift and complete phagocytosis of shed photoreceptor ...
Translation of the abstract (English)
The retinal pigment epithelium (RPE) is a close interaction partner of photoreceptors in the retina. Photoreceptors continuously renew their light sensitive outer segments in a process called disk shedding, in which they eliminate their most aged and destroyed tips once a day. The neighboring retinal pigment epithelium (RPE) is responsible for swift and complete phagocytosis of shed photoreceptor outer segment tips (POS). To maintain constant length of POS for life, a precise balance of POS shedding and phagocytosis is necessary. Circadian regulation coordinates the interactions for both cell types. Any disruption in this process causes photoreceptor dystrophy and blindness in animal models as well as in human disease. Whereas receptors mediating phagocytosis on the RPE cell surface have been identified the regulation in terms of post receptor signaling is not completely understood.
The aim of the work was to investigate the role of ion channels for regulation of phagocytosis using an in vitro assay and mice deficient for ion channels which have been identified as important contributors for this process. As a model for phagocytosis cultured primary porcine RPE cells were challenged with isolated photoreceptor outer segments. By means of pharmacological analysis using ion channel blockers we found that L-type Ca2+ channels and TRPV channels are involved in the process. Generation of Ca2+ signals could be here important for the regulation of further steps in signaling cascades during phagocytosis process. Bestrophin-1 interacts directly with Cav1.3 channels of the RPE and is able to inhibit the activity of L-type Ca2+ channels. In differential centrifugations endogenously expressed bestrophin-1 is found in fractions with enrichment of intracellular membrane proteins like ClC-3 Cl channel, which points to an intracellular localization of the protein. Bestrophin-1 further influences phagocytosis over its modulation on L-type channel activity in vitro. SiRNA knock-down of bestrophin-1 protein leads to increased phagocytosis, which goes along with an activating effect of L-type channels on phagocytosis. A direct functional coupling of large-conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ channel (BK) and L-type Ca2+ channel activity with a negative feedback mechanism is well known in the RPE. Pharmacological blockage of BK leads to reduced phagocytosis activity in vitro, meaning that direct antagonism doesn´t play prominent role in the process. Further results demonstrate that Cav1.3 and BK channels play a role in the circadian regulated process of phagocytosis in vivo. Immunhistochemical stainings of retina sections established from retina tissues harvested at different day times allowed quantification of phagosomes to measure phagocytosis activity in mice deficient for Cav1.3 or BK channel. Cav1.3-/- animals show differences in the morning peak activity. During the day knockout animals exhibit a higher number of phagosomes compared to wild-type. BK-/- mice showed shifts in the rhythmicity during morning peak phagocytic activity and over the day less phagosomes. Additionally these mice exhibit structural changes in the retina with shorter photoreceptor outer segments. Altogether this data demonstrate that the studied ion channels are important for normal regulation of phagocytosis in the RPE. A functional defect of these channels could have implications for human disorders linked to impaired phagocytosis.
Metadata last modified: 02 Jun 2018 09:34
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