| License: Publishing license for publications including print on demand (8MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-274737
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.27473
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 4 February 2013 |
| Referee: | Prof. Dr. Ernst Holler |
| Date of exam: | 17 January 2013 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Innere Medizin III (Hämatologie und Internistische Onkologie) |
| Keywords: | graft-versus-host-disease, Marker, Früherkennung, Diagnose, Prognose |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 27473 |
Abstract (German)
Die graft-versus-host disease tritt bei etwa 30-60% aller Patienten in den ersten Monaten nach allogener Stammzelltransplantation auf. Die Frühmortalität ist durch sie deutlich erhöht. Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war, durch Analyse zytologischer Marker sowie des Zytokeratin18 Fragments Parameter zu erarbeiten, die eine frühzeitige Diagnose einer Spender-gegen-Wirts-Reaktion sowie Aussagen ...
Abstract (German)
Die graft-versus-host disease tritt bei etwa 30-60% aller Patienten in den ersten Monaten nach allogener Stammzelltransplantation auf. Die Frühmortalität ist durch sie deutlich erhöht.
Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war, durch Analyse zytologischer Marker sowie des Zytokeratin18 Fragments Parameter zu erarbeiten, die eine frühzeitige Diagnose einer Spender-gegen-Wirts-Reaktion sowie Aussagen hinsichtlich des Therapieansprechens und des Risikos eines weiteren GvHD-Schubes ermöglichen. Es wurden 75 Patienten mit hämatologischen Neoplasien eingeschlossen, die sich im Zeitraum zwischen März 2008 und August 2009 einer allogenen Stammzelltransplantation am Universitätsklinikum Regensburg unterzogen. Untersucht wurden neben dem CK18F allgemeine Marker wie Leukozytenzahlen, PBMNC-, CD4- und CD8-Werte sowie die Aktvierungsmarker CD25 auf CD4- und CD8-Lymphozyten und CD95 auf den T-Helferzellen. Zudem fand eine Analyse der FoxP3-positiven Tregs sowie der organspezifischen Marker CCR10 auf den CD4-Lymphozyten und α4β7-Integrin auf den naiven zytotoxischen T-Zellen statt. Wir ermittelten zusätzlich in Serumproben von 20 Patienten mit gesicherter Darm- und Leber-GvHD, die bereits innerhalb der zwei Jahre vor Beginn der Dissertation gesammelt worden waren, den CK18F-Spiegel. Es wurde eine Einteilung vorgenommen in Patienten, die im weiteren Verlauf an einer graft-versus-host disease erkrankten, und in Patienten, die keine Manifestation entwickelten. Die Werte 22 hämatologisch gesunder Personen dienten als Kontrollen. Zellpopulationen und CK18F-Spiegel wurden jeweils bei Take, bei Erreichen eines CsA-Spiegels unter 100ng/mL, nach Absetzten von CsA und vier, acht und zwölf Wochen nach Ende der CsA-Prophylaxe untersucht. Lag bei Blutabnahme bereits eine Spender-gegen-Wirts-Reaktion vor, fanden entsprechende Analysen vor Steroidtherapie, vier Tage nach erster Kortisongabe und nach Reduktion der Prednisondosis unter 20 mg am Tag statt. Diese Werte wurden jeweils mit denen entsprechender Patienten ohne GvHD bei Abnahme verglichen. Es erfolgte eine Unterscheidung zwischen früher und später graft-versus-host disease.
Hinsichtlich der allgemeinen Parameter ergaben sich signifikant erniedrigte PBMNC-Werte bei Zusammenfassen aller Werte nach Sinken des CsA-Spiegels, wenn im weiteren Verlauf eine GvHD auftrat (M:1661,01/μL; s:205,00; n:31) gegenüber Transplantierten ohne Manifestation (M:2545,10/μL, s:369,35; n:10) (p:0,023). Zum gleichen Zeitpunkt waren bei Transplantierten mit späterer Spender-gegen-Wirts-Reaktion deutlich geringere CD4-Absolutwerte zu verzeichnen. Sowohl bei Zusammenfassung aller Werte nach Sinken des CsA-Spiegels als auch bei Take lagen relative und absolute Werte an zytotoxischen Zellen bei Patienten mit Entwicklung einer graft-versus-host disease im weiteren Verlauf signifikant unterhalb entsprechender Werte von Transplantierten, die nach Stammzellgabe nicht an einer Spender-gegen-Wirts-Reaktion erkrankten. Eine beginnende GvHD führt zur Schädigung des Thymus und sekundärer lymphatischer Organe mit konsekutiver Lymphopenie. Zudem werden Lymphozyten bei Entwicklung einer graft-versus-host disease vermehrt ins Gewebe aufgenommen. Signifikant erhöhte Leukozytenzahlen bei Patienten mit GvHD
nach Reduktion der Steroidtherapie im Vergleich zu Transplantierten ohne Spender-gegen-Wirts-Reaktion waren auf die Prednisongabe zurückzuführen.
Der Anteil CD95-positiver Zellen an den CD4-Lymphozyten war bei Zusammenfassung aller Werte nach Sinken des CsA-Spiegels signifikant höher, wenn sich später eine Spender-gegen-Wirts-Reaktion entwickelte. Analysen im Rahmen einer vorangehenden Dissertation hatten nach Engraftment hingegen niedrigere Prozentsätze bei Transplantierten mit Auftreten einer GvHD im weiteren Verlauf gezeigt [25]. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um definitive Aussagen treffen zu können. Bei Patienten, die bereits aufgrund einer akuten graft-versus-host disease mit Prednison behandelt wurden, wurden frühe und späte akute GvHD-Formen zusammengefasst und am vierten Tag nach erster Steroidgabe hinsichtlich des Auftretens oder des Überganges in eine chronische GvHD im weiteren Verlauf untersucht. Der Anteil CD95-positiver T-Helferzellen lag bei späterer Entwicklung einer chronischen Spender-gegen-Wirts-Reaktion mit 35,83% (s: 9,65; n:7) signifikant höher als bei GvHD-Patienten ohne spätere chronische Form (M: 16,35%; s:3,37; n: 22) (p: 0,021). Lag bereits eine Spender-gegen-Wirts-Reaktion vor, kam es vier Tage nach Beginn der Prednisontherapie bei Zusammenfassen der frühen und späten Form zu einer Verschiebung des CD25low-Anteils hin zu höheren CD25int.- und CD25high-Subsets verglichen mit Patienten ohne Vorliegen von Symptomen einer GvHD. Dies ist auf eine verstärkte Aktivierung der Zellen im Rahmen der graft-versus-host disease zurückzuführen.
Ziel der vorliegenden Untersuchung war unter anderem, die Bedeutung von CCR10 auf den CD4-positiven T-Zellen als Marker für die Haut-GvHD zu klären. Wurden frühe und späte Spender-gegen-Wirts-Reaktion zusammengefasst, waren die CCR10-positiven Anteile vor Steroidtherapie und am vierten Tag nach der ersten Prednisongabe bei Haut-GvHD-Patienten mit 3,95% (s:0,73; n:22) (p:0,042) bzw. 3,62% (s:0,64; n:22) (p:0,026) signifikant geringer als bei Transplantierten ohne Vorliegen einer Spender-gegen-Wirts-Reaktion (M:7,40%; s:0,99; n:66). Nach Reduktion der Steroiddosis unter 20mg am Tag drehte sich das Verhältnis allerdings um. Patienten mit Hautbefall besaßen hier einen CCR10-Anteil von 12,34% (s:2,59; n:23) gegenüber Transplantierten ohne GvHD-Symptome (M:7,40%; s:0,99; n:66) (p:0,027). Ein Vergleich aller GvHD-Patienten unabhängig vom Manifestationsorgan mit Transplantierten, bei denen zum Zeitpunkt der Blutentnahme keine Spender-gegen-Wirts-Reaktion vorlag, brachte ähnliche Ergebnisse, weshalb CCR10 nicht spezifisch für einen Befall der Haut zu sein scheint. Das α4β7-Intgerin auf den CD8-positiven T-Lymphozyten war in einer Publikation als möglicher Prädiktor einer Darm-GvHD vorgestellt worden [111]. Hier war ein erniedrigter Anteil α4β7-positiver Zellen an den CD8-Lymphozyten kurz nach Engraftment mit dem gehäuften Auftreten einer Darm-GvHD im weiteren Verlauf einhergegangen. In unserer Studie waren hingegen bei Erreichen eines Leukozytenwertes über 1000/μL die mittleren relativen Werte der Empfänger mit Darmbefall im späteren Verlauf (M:7,02%; s:3,96; n:5) gegenüber entsprechenden Zahlen von GvHD-Patienten mit anderen Manifestationsorten (M:0,57%; s:0,21; n:15) signifikant höher (p:0,021). Zudem hatten Patienten mit einer Darm-GvHD im Vergleich zu solchen mit anderen Manifestationsorten im Falle eines frühen Auftretens vor Therapiebeginn erhöhte Relativ- und Absolutwerte sowie größere Anteile von CD8/β7/CD45RA-positiven Zellen. Vor allem bei später Manifestation nach Reduktion der Steroidtherapie schien sich das Verhältnis eher umzukehren. Das α4β7-Integrin war spezifisch für den Befall des Intestinaltraktes.
Hinsichtlich des CK18F-Spiegels bestanden signifikante Unterschiede, wenn schwere Formen eines intestinalen oder hepatischen Befalls (M:1503,02 U/ml; Median: 1062,25 U/mL; s:651,06; n:6) mit den Werten von Patienten mit leichter intestinaler GvHD oder mit Befall eines anderen Organs (M:142,60 U/mL; Median: 97,43 U/mL; s: 34,75; n:26) am vierten Tag nach Beginn einer Steroidtherapie verglichen wurden (p:0,001). Zudem korrelierte zum gleichen Zeitpunkt bei Zusammenfassung der frühen und späten graft-versus-host disease die Höhe des CK18F-Spiegels mit der GvHD-assoziierten Mortalität. CK18F spielt somit eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung des Schweregrades einer Spender-gegen-Wirts-Reaktion.
Ein signifikanter Einfluss durch die Methode der Leukozytenbestimmung auf die Absolutzahlen konnte nicht nachgewiesen werden. Die unterschiedliche Gabe von ATG oder MMF war nicht Ursache der gefundenen signifikanten Unterschiede. Allerdings beeinflusste ATG signifikant den Anteil der T-Helferzellen an den PBMNCs sowie die Verteilung der einzelnen CD25- Subsets innerhalb der CD4-Lymphozyten. Ein Effekt auf die Tregs war nicht erkennbar.
Translation of the abstract (English)
Graft –versus-host disease occurs in about 30-60% of all patients in the first months after allogeneic stem cell transplantation. Early mortality is thereby highly increased. Aim of this study was to identify parameters for early diagnosis of gvhd, treatment response and risk of second attack of gvhd by analyzing cytological markers as well as cytokeratin18 fragment. 75 patients with ...
Translation of the abstract (English)
Graft –versus-host disease occurs in about 30-60% of all patients in the first months after allogeneic stem cell transplantation. Early mortality is thereby highly increased.
Aim of this study was to identify parameters for early diagnosis of gvhd, treatment response and risk of second attack of gvhd by analyzing cytological markers as well as cytokeratin18 fragment. 75 patients with hematological neoplasia, that underwent allogeneic stem cell transplantation during the period of March 2008 and August 2009 at the University Hospital of Regensburg, were included. Besides CK18F common markers like white blood cell count, PBMC, CD4, CD8 positive lymphocytes and markers of activation like CD25 on CD4 and CD8 lymphocytes as well as CD95 on T helper cells were analyzed. In addition the population of FoxP3 positive Tregs as well as organospecific markers like CCR10 on CD4 lymphocytes and α4β7 integrin on naive cytotoxic T cells were investigated. In addition, we measured CK18F in sera of 20 patients with proven intestinal and liver gvhd, which were collected already within the two years preceding this study. Patients were separated into those developing gvhd in the later course and those without any manifestation. Results of 22 volunteers without any hematological disorders were used as controls. Cell populations and CK18F were measured when patients reached a white blood cell count of > 1000/μL, after reaching a level of CsA under 100ng/mL, after stopping CsA and four, eight and twelve weeks after stopping prophylaxis with CsA. Within patients already suffering from gvhd at time of blood sampling, measurements were conducted before gvhd therapy with steroids, four days after first application of cortisone and after reduction of prednisone under 20mg per day. Results were compared to values of patients without ghvd at time point of blood sampling. We distinguished between early and late gvhd.
Summarizing all values after reduction of CsA level, significant lower PBMC were found within patients who developed gvhd in the later course (M:1661,01/μL; s:205,00; n:31) compared to persons after transplantation without any manifestation (M:2545,10/μL, s:369,35; n:10) (p:0,023). At the same point of time patients who came down with gvhd at a later point of time had significant lower absolute CD4 lymphocyte counts. Summarizing all results after reduction of CsA level as well as at point of time of reaching a white blood cell count of >1000/μL, relative and absolute values of cytotoxic T cells within patients with development of gvhd in the later course were significant lower compared to those of patients not suffering from gvhd after transplantation. At the beginning gvhd leads to impairment of the thymus as well as secondary lymphatic organs causing lymphopenia. In addition, infiltration of the tissue by lymphocytes is increased during development of gvhd. Significantly higher white blood cell counts in patients suffering from gvhd after reduction of steroids compared to persons without gvhd where caused by prednisone treatment.
The percentage of CD95 positive CD4 lymphocytes was highly increased in case of gvhd development in the later course when summarizing all values after reduction of CsA level. In a preceding study lower percentages in persons attacked by ghvd in the later course were found after engraftment [25]. Further investigations need to be done to meet a final statement. Results at day four after first steroid
application of patients who were already treated with prednisone because of early and late acute gvhd were summarized and analyzed with regard to development of chronic gvhd. Percentages of CD95 positive T helper cells were significantly higher when chronic gvhd occurred at a later time point (M:35,83% ; s: 9,65; n:7) compared to patients suffering from gvhd without incidence of later chronic graft-versus-host disease (M: 16,35%; s:3,37; n: 22) (p: 0,021). Within gvhd patients the percentage of CD25 low cells was shifted to higher CD25 int. and CD25 high subsets four days after the beginning of prednisone therapy when summarizing early and late manifestation versus patients without any symptoms of gvhd. This can be ascribed to enhanced activation of cells during ghvd.
We also intended to investigate the role of CCR10 on CD4 positive T lymphocytes as a marker of graft-versus-host disease involving skin. When early and late manifestations of ghvd were subsumed, the ratio of CCR10 positive cells was markedly lower in patients with skin gvhd before and four days after first steroid application (3,95%; s:0,73; n:22) (p:0,042) respectively (3,62%; s:0,64; n:22) (p:0,026) compared to persons without gvhd (M:7,40%; s:0,99; n:66). After reduction of steroid therapy under 20mg per day proportions were inverted. Patients suffering from gvhd of the skin showed a percentage of CCR10 positive cells of 12,34% (s:2,59; n:23) versus persons without gvhd manifestation after transplantation (M:7,40%; s:0,99; n:66) (p:0,027). If values of all gvhd patients irrespective of involved organ were compared to transplanted persons, who did not suffer from gvhd at the time point of blood sampling, similar results were obtained. Therefore CC10 does not seem to be specific to involvement of the skin. A4β7 integrin on CD8 positive T lymphocytes was discussed as a possible predictor of intestinal gvhd [111]. A lower percentage of α4β7 integrin on CD8 lymphocytes after engraftment had shown a positive correlation with occurrence of intestinal gvhd in the later course. However, in our study relative values of hosts with intestinal involvement in the later course (M:7,02%; s:3,96; n:5) where significantly higher after engraftment versus values of patients suffering from ghvd manifestation in other organs (M:0,57%; s:0,21; n:15) (p:0,021). In addition patients with intestinal gvhd showed increased relative and absolute counts as well as increased percentages of CD8/β7/CD45RA positive cells in case of early gvhd before first application of steroids compared to gvhd patients with manifestations in other organs. Especially in case of late manifestation after reduction of steroids the proportions seemed to be inverted. A4β7 integrin was specific to intestinal involvement.
Concerning CK18F significant differences were found, if severe gvhd of liver or intestine four days after start of steroids (M:1503,02 U/ml; Median: 1062,25 U/mL; s:651,06; n:6) were compared to levels of patients with mild intestinal gvhd or with involvement of other organs (M:142,60 U/mL; Median: 97,43 U/mL; s: 34,75; n:26) (p:0,001). Besides, at the same time point levels of CK18F correlated with gvhd associated mortality when cases of early and late manifestations where subsumed. Therefore CK18F plays a major role in determining severity of gvhd.
A significant influence of white blood cell count measurement on absolute counts was not detected. The different application of ATG or MMF was not responsible for the obtained significant differences.
However, ATG affected the percentage of T helper cells within PBMC as well as C25 subsets within CD4 lymphocytes. An influence on Tregs was not observed.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 03:14
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