Arnold, Lea
(2014)
Studien zur Regulation und Funktion der Polo-Kinase Cdc5 im Zellteilungszyklus der Hefe Saccharomyces cerevisiae.
PhD, Universität Regensburg.
Date of publication of this fulltext: 06 Feb 2014 14:48
Abstract (German)
Die Polo-Kinasen sind multi-funktionelle Regulatoren des eukaryotischen Zellteilungszyklus. Sie sind hoch konserviert und gehören zu den Serin/Threonin-Kinasen. Während sich im
N-terminalen Bereich die katalytische Domäne befindet, enthält der C-terminale Bereich die charakteristische Polo-Box-Domäne. Sie vermittelt die Substrat-Bindung und die subzelluläre Lokalisation der Polo-Kinasen. Der ...
Abstract (German)
Die Polo-Kinasen sind multi-funktionelle Regulatoren des eukaryotischen Zellteilungszyklus. Sie sind hoch konserviert und gehören zu den Serin/Threonin-Kinasen. Während sich im
N-terminalen Bereich die katalytische Domäne befindet, enthält der C-terminale Bereich die charakteristische Polo-Box-Domäne. Sie vermittelt die Substrat-Bindung und die subzelluläre Lokalisation der Polo-Kinasen. Der einzige Vertreter der Familie der Polo-Kinasen in Saccharomyces cerevisiae ist Cdc5. Cdc5 und die zyklinabhängige Kinase Cdk1 kooperieren hinsichtlich ihrer Aktivität miteinander. Zum einen fördern Cdc5 und Cdk1 zu Beginn der Mitose die Transkription des CLB2-Genclusters, zu dem das Zyklin CLB2 und CDC5 selbst gehören und zum anderen trägt Cdc5 zur Destabilisierung eines mitotischen Cdk1-Inhibitors bei. Während der Mitose fördert Cdc5 die Kondensation sowie die Trennung der Schwesterchromatiden. Als Komponente des FEAR- und des MEN-Signalwegs ist Cdc5 an der Aktivierung der Phosphatase Cdc14 und am Austritt aus der Mitose beteiligt. Die präzise Regulation der Cdc5-Aktivität ist für einen reibungslosen Ablauf des Zellteilungszyklus erforderlich.
Durch phasenspezifische Transkription und Ubiquitin-vermittelte Proteolyse fluktuiert der Proteinlevel von Cdc5 während des Zellteilungszyklus. Für die APCHct1-vermittelte Degradation ist die N-terminale Domäne von Cdc5 notwendig. Diese Arbeit zeigt mittels
live-cell imaging und in vivo Degradationsanalysen, dass die N-terminale Domäne nicht nur notwendig, sondern auch hinreichend für die Instabilität sowie die Kernlokalisation ist. Die KEN-Box konnte als das entscheidende Degron identifiziert werden, während die vermeintlichen D-Boxen zur Kernlokalisation beitragen. Insgesamt zeigten die Degradationsstudien, dass die Lokalisation im Zellkern wichtig für die APCHct1-vermittelte Proteolyse ist.
Neben der regulierten Instabilität wird die Aktivität von Cdc5 durch Cdk1-abhängige Phosphorylierung des Threoninrests T242 innerhalb des Aktivierungsloops der Kinase-Domäne kontrolliert. Diese Arbeit zeigt, dass die Konsensussequenzen für die Cdk1- Phosphorylierung im N-terminalen Bereich zusätzlich für die normale biologische Funktion von Cdc5 wichtig sind. Mit Hilfe von genetischen Interaktionsstudien und Analyse der in vivo Phosphorylierung von Zielproteinen wie Cdc14 und Bfa1 konnte nachgewiesen werden, dass insbesondere die Cdc14-Aktivierung durch die Phosphorylierung der N-terminalen Domäne von Cdc5 reguliert wird.
Zusätzlich zu den bekannten positiven Funktionen zum Fortschreiten der Mitose weisen die Ergebnisse dieser Arbeit Cdc5 eine Rolle als negativer Regulator des Spindelkontrollsystems (SAC) zu. In dieser Arbeit konnte mittels Co-Immunpräzipitation gezeigt werden, dass erhöhte Mengen von Cdc5 die Interaktion der SAC-Komponente Mad2 mit dem APC-Aktivator Cdc20 verhinderten. Des Weiteren verringerten erhöhte Mengen von Cdc5 die Lokalisation der SAC-Komponente Mad1 am unbesetzten Kinetochor. Als Konsequenz daraus konnte auch die Lokalisation von Mad2 und Bub3 am unbesetzten Kinetochor bei erhöhten Mengen von Cdc5 nicht aufrechterhalten werden. Cdc5 wurde als Gegenspieler der SAC-Kinase Mps1, die zur Aktivierung des Spindelkontrollsystems notwendig ist, identifiziert. Eine mögliche direkte Wirkung von Cdc5 auf Mps1 ist denkbar, da die elekrophoretische Mobilität von Mps1 in der Westernblot-Analyse durch die Überexpression von Cdc5 reduziert war.
Zusammengenommen weisen alle diese Ergebnisse darauf hin, dass die N-terminale Domäne von Cdc5 sowohl negative als auch positive Eigenschaften hat. Einerseits ist der N-terminale Bereich notwendig und hinreichend für die Instabilität in G1 und andererseits sind die
N-terminalen Konsensussequenzen für die Cdk1-Phosphorylierung wichtig für die biologische Funktion. Darüber hinaus konnte Cdc5 als negativer Regulator des Spindelkontrollsystems identifiziert werden, wobei die präzisen Zielproteine noch bestimmt werden müssen.
Translation of the abstract (English)
The polo-like kinases (Plks) are multi-functional regulators of the eukaryotic cell division cycle. They are highly conserved and belong to the serine/threonine-kinases. Plks are characterized by their C-terminal polo box domain, which recognizes phosphorylated target proteins and contributes to the subcellular localization of Plks. The catalytic domain is localized within the N-terminal region. ...
Translation of the abstract (English)
The polo-like kinases (Plks) are multi-functional regulators of the eukaryotic cell division cycle. They are highly conserved and belong to the serine/threonine-kinases. Plks are characterized by their C-terminal polo box domain, which recognizes phosphorylated target proteins and contributes to the subcellular localization of Plks. The catalytic domain is localized within the N-terminal region. Cdc5 is the only member of the polo kinase family in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Cdc5 and the cyclin-dependent kinase Cdk1 cooperate with respect to their biological and enzymatic activity. At the beginning of mitosis Cdc5 and Cdk1 stimulate transcription of the CLB2 gene cluster, which includes the cyclin CLB2 and CDC5 itself. In addition, Cdc5 contributes to destabilization of a mitotic Cdk1 inhibitor. During mitosis condensation of chromosomes is regulated and separation of sister chromatids is facilitated by Cdc5. As part of the FEAR and the MEN pathways, Cdc5 promotes activation of the phosphatase Cdc14 and the exit from mitosis. Thus, tight control of Cdc5 activity is important for an accurate cell division cycle.
By phase-specific gene transcription and ubiquitin-mediated proteolysis, protein levels of Cdc5 fluctuate in a cell cycle-dependent manner. Instability of Cdc5 depends on the ubiquitin ligase APCHct1 and requires the N-terminal domain. By using live-cell imaging and in vivo degradation studies, it was shown that the N-terminal region is not only necessary but also sufficient for instability and nuclear localization. The KEN box was identified as the key degron, whereas the potential D boxes contributed to nuclear localization of Cdc5N80. In addition, data of this work suggest that nuclear localization of APCHct1 target proteins is important for their degradation.
Aside from regulated instability, the activity of Cdc5 is controlled via Cdk1-dependent phosphorylation of the T-loop residue T242 in the catalytic domain. This work shows that consensus sites for phosphorylation by Cdk1 within the N-terminal domain are also important for the normal function of Cdc5. Analysis of genetic interactions and in vivo phosphorylation of target proteins like Cdc14 and Bfa1 indicated that activation of Cdc14 in particular is regulated by the phosphorylation of the N-terminal domain of Cdc5.
In addition to the already known positive functions in promoting progression through mitosis the data of this work assign to Cdc5 the role of a negative regulator of the spindle assembly checkpoint (SAC). Via coimmunoprecipitation it was shown that high levels of Cdc5 prevent interaction of the SAC component Mad2 with the APC activator Cdc20. Moreover, localization of the SAC component Mad1 at the unattached kinetochore was prevented by high levels of Cdc5. As a consequence of this, localization of Mad2 and Bub3 at the unattached kinetochore was neither maintained in the presence of high levels of Cdc5. Cdc5 was found to counteract the SAC kinase Mps1, which is required for activation of the SAC. Mps1 might be a direct target protein of Cdc5 since the electrophoretic mobility of Mps1 was reduced by Cdc5 overexpression in western blot analysis.
All together the data show that the N-terminal domain of Cdc5 has negative and positive functions. On the one hand, the N-terminal region was required and sufficient for instability in G1. On the other hand, the N-terminal consensus sites for phosphorylation by Cdk1 were important for normal function of Cdc5. In addition to this, Cdc5 was identified as a negative regulator of the spindle assembly checkpoint, but the direct target proteins of Cdc5 have yet to be discovered.
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