Im Gegensatz zu bakteriellen Fimbrien und Pili, deren Struktur und Assemblierungsmechanismus zum Teil bis auf molekulare Ebene geklärt sind, existieren noch kaum Daten zu archaeellen Fimbrien. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war daher eine nähere Untersuchung der 5 nm dicken Mth60-Fimbrien von Methanothermobacter thermoautotrophicus, die dem Organismus als Adhäsionsstrukturen dienen.
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Abstract (German)
Im Gegensatz zu bakteriellen Fimbrien und Pili, deren Struktur und Assemblierungsmechanismus zum Teil bis auf molekulare Ebene geklärt sind, existieren noch kaum Daten zu archaeellen Fimbrien. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war daher eine nähere Untersuchung der 5 nm dicken Mth60-Fimbrien von Methanothermobacter thermoautotrophicus, die dem Organismus als Adhäsionsstrukturen dienen. Zu diesem Zweck musste zunächst eine größere Menge der Fimbrien isoliert werden. Dies wurde erreicht, indem die Zellanhänge, die im Laufe der Zellernte abgeschert worden waren, aus dem Zentrifugationsüberstand gefällt wurden. Ferner wurde auch eine weitere Methode zur Gewinnung der Fimbrien etabliert: Dabei handelte es sich um die Freisetzung der zellassoziierten Fimbrien über einen enzymatischen Verdau der Pseudomurein-Zellwand. Diese Methode kann in Zukunft vor allem dazu herangezogen werden, um potentielle Verankerungsstrukturen der Fimbrien aufzuzeigen. Erste Hinweise auf solche Verankerungen lieferten sowohl die Fimbrien von M. thermoautotrophicus als auch die von Methanothermobacter marburgensis. Antikörper, die gegen die Mth60-Fimbrien von M. thermoautotrophicus generiert und auf Kreuzreaktionen mit den Fimbrien von M. marburgensis und Methanothermus fervidus getestet wurden, zeigten die Einzigartigkeit der Mth60-Fimbrien auf. Diese wurde auch über in silico Analysen bestätigt. Der Hauptbestandteil der Fimbrien von M. thermoautotrophicus ist das Hauptfimbrin Mth60, dessen kodierende Sequenz mit den benachbarten Genen innerhalb der beiden Operons mth61/mth60 und mth60/mth59/mth58 co-transkribiert wird. Über qRT-PCR wurde gezeigt, dass sich trotz dieser Co-Transkriptionen das mth60-Einzeltranskript um ein Vielfaches stärker in der Zelle akkumuliert, verglichen mit allen anderen (Co-)Transkripten. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der Funktion von Mth60 als Hauptbestandteil der Fimbrien. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es erstmalig, Mth60 in größeren Mengen und ohne Verunreinigungen durch E. coli-Proteine rekombinant herzustellen. Dies wurde über ein künstliches Genkonstrukt bewerkstelligt, das zum einen an die codon usage von E. coli angepasst worden war und zum anderen die Co-Expression von mth59 ermöglichte. Dieses Gen kodiert für ein Protein, das laut bioinformatischen Analysen signifikante Homologien zu bestimmten periplasmatischen Chaperonen von Gram-negativen Bakterien aufweist. Diese Chaperone sind als Bestandteil des Chaperon-Usher-Pathways an der Assemblierung zahlreicher Oberflächenstrukturen, darunter verschiedener Pili, essentiell beteiligt. Die Chaperon-Funktion von Mth59 konnte über Co-Immunpräzipitationen mit rekombinanten Proteinen bestätigt werden, indem gezeigt wurde, dass Mth59 spezifisch mit dem Hauptfimbrin Mth60 interagiert. Über in vitro Polymerisationsstudien wurde ferner die Fähigkeit des rekombinanten Mth60, sich selbstständig zu Fimbrien zusammenzulagern, aufgedeckt. Die auf diese Weise entstandenen Filamente glichen in ihrem Durchmesser den nativen Fimbrien. Die Polymerisation erfolgte in Abwesenheit von Enzymen und Energie und stellt damit eine weitere Gemeinsamkeit der Mth60-Fimbrien und der Pili Gram-negativer Bakterien dar. Aufgrund dieser Ergebnisse kann also – im Hinblick auf den Assemblierungsmechanismus – von einer gewissen Ähnlichkeit zwischen den Mth60-Fimbrien und den Pili Gram-negativer Bakterien ausgegangen werden.
Translation of the abstract (English)
In contrast to bacterial fimbriae and pili, whose structures and mechanisms of assembly are partially known down to molecular details, there is hardly any data available on archaeal fimbriae. Therefore, the aim of this work was to investigate the Mth60 fimbriae of Methanothermobacter thermoautotrophicus. These cell appendages have a diameter of 5 nm and serve as adhesion organelles.
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Translation of the abstract (English)
In contrast to bacterial fimbriae and pili, whose structures and mechanisms of assembly are partially known down to molecular details, there is hardly any data available on archaeal fimbriae. Therefore, the aim of this work was to investigate the Mth60 fimbriae of Methanothermobacter thermoautotrophicus. These cell appendages have a diameter of 5 nm and serve as adhesion organelles. A large amount of fimbriae was obtained by precipitating the supernatant, as fimbriae were sheared off the cells during centrifugation. Moreover, another method for the isolation of Mth60 fimbriae was established: It could be shown that cell-associated fimbriae are released from the cell wall through enzymatic digestion of the pseudomurein. This knowledge can be used in future to determine potential anchoring structures of Mth60 fimbriae. Initial hints for such anchoring structures were found on fimbriae of M. thermoautotrophicus and Methanothermobacter marburgensis. Antibodies raised against the Mth60 fimbriae of M. thermoautotrophicus showed the uniqueness of these cell appendages, since no cross reaction with the fimbriae of M. marburgensis and Methanothermus fervidus could be detected. In silico analyses confirmed these results. The glycoprotein Mth60 is the main component of the fimbriae of M. thermoautotrophicus. The gene encoding this protein is part of two operons: it is co-transcribed with mth61 and a second operon comprises mth60, mth59 and mth58. Quantitative RT-PCR showed that mth60 is transcribed much higher than the other genes. This finding coincides with Mth60 as main fimbrin. In this work we succeeded for the first time to obtain a high amount of recombinant Mth60 that was not contaminated with E. coli proteins. This was achieved by an artificial gene construct which had been optimized to the codon usage of E. coli and furthermore allowed the co-expression of mth59. As indicated by bioinformatical studies, Mth59 shows significant homologies to specific periplasmatic chaperones of Gram negative bacteria. Being part of the chaperone-usher-pathway, these chaperones are essential for the assembly of different cell surface structures, including different pili. Co-immunoprecipitation with recombinant proteins confirmed the chaperone character of Mth59, since it interacted specifically with Mth60. In vitro polymerization studies clearly showed that recombinant Mth60 spontaneously forms filaments which have the same diameter as native fimbriae. The polymerization occurred in absence of enzymes and energy and thus, another similarity between Mth60 fimbriae and pili of Gram negative bacteria was found. Altogether, these results indicate a certain similarity between the assembly mechanisms of the archaeal Mth60 fimbriae and pili of Gram negative bacteria.
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