Etablierung eines in-vitro-Modells zur gemischten Adipogenese und Osteogenese von humanen mesenchymalen Stammzellen und der Einfluss von 17-ß-Östradiol auf die gemischte Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen
HINTERGRUND:
Zellbiologische Veränderungen unter dem Einfluss von Stressfaktoren bei der adipogenen und osteogenen Differenzierung von hMSCs wurden bisher in Monokulturen untersucht. Um interzelluläre Einflüsse mit einzubeziehen, wurde ein in-vitro Modell für gemischte Adipo-und Osteogenese entwickelt und anschließend auf den Einfluss von 17-ß-Östradiol hin angewendet.
METHODEN:
Humane ...
Abstract (German)
HINTERGRUND: Zellbiologische Veränderungen unter dem Einfluss von Stressfaktoren bei der adipogenen und osteogenen Differenzierung von hMSCs wurden bisher in Monokulturen untersucht. Um interzelluläre Einflüsse mit einzubeziehen, wurde ein in-vitro Modell für gemischte Adipo-und Osteogenese entwickelt und anschließend auf den Einfluss von 17-ß-Östradiol hin angewendet.
METHODEN: Humane mesenchymale Stammzellen wurden aus dem Beckenkamm isoliert und proliferiert. Um die geeignete Zusammensetzung der Medien für sowohl osteogene und adipogene 2D-Differenzierung als auch eine ausgewogene gemischte Kultur zu erhalten, wurden die hMSCs mit rein adipogenen (Dex 10E-6M, Insulin 1-5 µg/ml,IBMX 0-0,5 mM) und osteogenen (Dex 10E-8M, Asc 50 µg/ml, ßGP 5mM, Vit D3 1-10 nM) Zusätzen differenziert. Auch bei der gemischten Kultur wurde mit den Supplementen variiert (Dex 10E-7, Asc 50 µg/ml, ßGP 5mM, Vit D3 1-10 nM, Insulin 1-5 µg/ml, IBMX 0-0,5 mM). Die Auswertung bezüglich der Modelletablierung erfolgte histologisch (Alizarin Red, Oil Red O) und biochemisch (Alkaline Phosphatase-Aktivität, Ca-Bestimmung mittels Alizarin Red, DNA-Quantifizierung, G3PDH-Aktivität). Der Einfluss von 17ßÖstradiol in den Konzentrationen 10E-12, 10 E-10, 10E-8 wurde zusätzlich mittels quantitativer Real-Time PCR bezüglich der oceocalcin-, runx2v3-, ppary- und LPL-Expression untersucht, welche zu hprt normiert wurde.
ERGEBNISSE: Eine optimale Osteo-und Adipogenese sowie gemischte Differenzierung ergab sich histologisch (Alizarin Red, Oil Red O) und biochemisch (Alkaline Phosphatase-Aktivität, Ca-Bestimmung mittels Alizarin Red, DNA-Quantifizierung, G3PDH-Aktivität) mit Dex 10E-7, Asc 50 µg/ml, ßGP 5mM, Insulin 5 µg/ml, IBMX 0,5 mM. 17-ß-Östradiol fördert konzentrationsabhängig die Adipogenese in rein adipogener Differenzierung (phänotypisch, genetisch, biochemisch). Die G3PDH-Aktivität in rein adipogener Differenzierung ist ausgeprägter als in gemischter Differenzierung. Die Adipogenese ist in gemischter Differenzierung reduziert. Eine eindeutige Hormonabhängigkeit bei reiner Osteogenese ist nicht nachzuweisen gewesen. Bei gemischter Differenzierung verschiebt sich das Gleichgewicht verstärkt in Richtung Osteogenese, wobei diese in gemischter Kultur früher beginnt als bei rein osteogener Differenzierung.
DISKUSSION: Eine gleichtzeitige adipogene und osteogne Differenzierung von hMSCs nebeneinander ist möglich. Dies bietet die Möglichkeit, grundlegende Mechanismen unter dem Einfluss von Stressfaktoren in der Biologie der hMSCs zu untersuchen. Östrogen scheint die Adipogenese zu förden. Ein positiver Effekt im Rahmen der Osteogenese konnte in diesem Modell nicht gezeigt werden. Bei gemischter Differenzierung verschiebt sich das Gleichgewicht Richtung Osteogenese ohne eindeutigen Hormoneinfluss.
Translation of the abstract (English)
Background:
Alterations of the cell biology of human mesenchymal stem cells (hMSCs) have been investigated in many ways in monocultures. To implicate intercellular Influences we developed a mixed osteogenic and adipogenic in-vitro-model and subsequently analysed the influence of 17-ß-estradiol.
Methods:
hMSCs were isolated from bone marrow aspirates from iliac crest and were proliferated. To ...
Translation of the abstract (English)
Background: Alterations of the cell biology of human mesenchymal stem cells (hMSCs) have been investigated in many ways in monocultures. To implicate intercellular Influences we developed a mixed osteogenic and adipogenic in-vitro-model and subsequently analysed the influence of 17-ß-estradiol.
Methods: hMSCs were isolated from bone marrow aspirates from iliac crest and were proliferated. To find the appropriate medium for osteogenic, adipogenic and mixed differentiation the hMSCs were cultured with osteogenic (Dex 10E-8M, Asc 50 µg/ml, ßGP 5mM, Vit D3 1-10 nM) and adipogenic growth factors (Dex 10E-6M, Insulin 1-5 µg/ml, IBMX 0-0,5 mM). For mixed differentiation supplements were varied (Dex 10E-7, Asc 50 µg/ml, ßGP 5mM, Vit D3 1-10 nM, Insulin 1-5 µg/ml, IBMX 0-0,5 mM). Analysis was made by staining (Alizarin Red, Oil Red O) and biochemic methods (alkaline phosphatase-activity, calcium-quantification, DNA-quantification, G3PDH-activity). Influence of 17-ß-estradiol (10E-12, 10 E-10, 10E-8) was additional investigated by measuring the osteocalcin-, runx2v3-, ppary- and LPL-expression normalised to hprt in real-time PCR.
Results: A well-balanced osteogenic, adipogenic and mixed differentiation was obtained histological (alizarin red, oil red o) and biochemical (alkaline phosphatase-activity, calcium-quantification, DNA-quantification, G3PDH-activity) with Dex 10E-7, Asc 50 µg/ml, ßGP 5mM, insulin 5 µg/ml, IBMX 0,5 mM. 17-ß-estradiol stimulated adipogenesis in adipogenic differentiation medium dependent on its concentration (phenotypic, genetic, biochemic). G3PDH activity was more distinct in single adipogenic differentiation than in mixed medium. In mixed differentiation adipogenesis was reduced. A distinct hormone influence on single osteogenic differentiation was not proven. In mixed differentiation the equilibration is shifted to osteogenesis and it started earlier than in monoculture.
Discussion: A simultaneous osteogenic and adipogenic differentiation of hMSCs is possible. This model of simultaneous adipogenic and osteogenic differentiation allows investigating different mechanisms under the influence of various stress factors. Estradiol seems to stimulate the adipogenesis. A positive effect on the osteogenesis could not be demonstrated. In mixed differentiation the equilibration is shifted to osteogenesis without explicit hormone dependence.
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