| License: Publishing license for publications excluding print on demand (17MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-283843
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.28384
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 15 January 2014 |
| Referee: | Prof. Dr. Ralf Wagner |
| Date of exam: | 11 June 2013 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene |
| Keywords: | HIV, vaccine, cross priming, EHV, NYVAC, Vakzine, Impfstoff, AIDS, MDDC, Monocyte Derived Dendritic Cells |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 28384 |
Abstract (German)
EHV-C ist im Gegensatz zu NYVAC-C in der Lage, dendritische Zellen zu infizieren und zu maturieren. Das konnte in zahlreichen Vorarbeiten der Arbeitsgruppe gezeigt werden. In der vorliegenden Arbeit sollte das Cross Priming Potential der Vakzindekandidaten EHV-C und NYVAC-C auf dendritischen Zellen untersucht werden. Zum einen müssten dendritische Zellen nicht direkt infiziert werden, um eine ...
Abstract (German)
EHV-C ist im Gegensatz zu NYVAC-C in der Lage, dendritische Zellen zu infizieren und zu maturieren. Das konnte in zahlreichen Vorarbeiten der Arbeitsgruppe gezeigt werden. In der vorliegenden Arbeit sollte das Cross Priming Potential der Vakzindekandidaten EHV-C und NYVAC-C auf dendritischen Zellen untersucht werden. Zum einen müssten dendritische Zellen nicht direkt infiziert werden, um eine zelluläre Immunantwort zu generieren. Zum anderen könnte durch Cross Priming auch eine Immunantwort gegen solche Viren gewährleistet werden, die die konventionelle MHC-I-Antigen-Prozessierung spezifisch inhibieren. Gerade bei der Verwendung der Vakzine NYVAC-C fällt auf, dass nach Infektion der dendritischen Zellen in vitro keine Maturierung erfolgt, jedoch in vivo als Teil einer DNA prime/NYVAC boost Vakzinierungsstrategie eine T-Zell Antwort generiert wird.41
Um das Cross Priming Potential der Vakzinekandidaten EHV-C und NYVAC-C zu untersuchen, sollte eine fibrozytenähnliche Zelllinie infiziert werden. Deren Überstände wurden dazu verwendet MDDCs zu maturieren. Diese Maturation wurde mittels FACS-Analyse spezifischer Oberflächenmarker (CD80, CD83, HLA-DR, CD86, CD40, CCR7) und durch die Produktion maturationsspezifischer Zytokine IL-6, IL-10, IL-12 und TNF-alpha gemessen. Außerdem wurden die maturierten MDDCs mit zytotoxischen T-Zellen, die bereits Kontakt mit dem HI-Virus hatten, inkubiert. Die daraus resultierende Interferon-γ Produktion der zytotoxischen T-Zellen wurde mittes Elispot bestimmt.
Zunächst wurden MRC-5 Zellen als zu infizierende Zelllinie verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass auch nicht infizierte MRC-5 Zellen in der Lage sind, MDDCs zu maturieren. Deswegen wurde ein autologes Zellkultursystem entworfen, um eine Aktivierung von MDDCs durch inkompatible Zellen zu vermeiden. Dafür wurde eine Methode entwickelt aus PBMCs fibrozytenähnliche Zellen zu generieren. Die Überstände infizierter autologer Fibrozyten stimulierten MDDCs, die vom gleichen Spender stammten. Einerseits erfolgte so keine Maturation durch nicht infizierte autologe Fibrozyten. Andererseits war festzustellen, dass MDDCs durch den Überstand EHV-C infizierter Fibrozyten gut maturiert werden können. Diese Vorgehensweise resultierte in einer besseren Maturation der MDDCs als durch die direkte Infektion der MDDCs mit EHV-C. Der Überstand NYVAC-C infizierter Fibrozyten bewirkte keine Maturation bei den MDDCs. Tendenziell konnten diese FACS-Ergebnisse auch durch die Produktion eines maturationsspezifischen Zytokinprofils bestätigt werden. CD8+ T-Zellen, die vorher Kontakt mit Epitopen des HI-Virus hatten, wurden durch vorher maturierte MDDCs stimuliert. EHV-B kann nach Infektion von Fibrozyten über die Stimulation von MDDCs bei den zytotoxischen T-Zellen eine Interferon-γ Produktion auslösen. Dies bestätigt das Cross Priming Potential von EHV-C. Besonders zu vermerken ist, dass die Stimulation mit dem Pellet NYVAC-infizierter Fibrozyten in einer ähnlich hohen Interferon-γ Produktion resultiert. Während die Stimulation mit Fibrozyten-Überstand, dem Pellet, beides einmal auch durch UV-Strahlung inaktiviert, im Vergleich keine sonderlichen Unterschiede zeigt, ist die maturationsspezifische Oberflächenmarkerexpression auf MDDCs durch die Stimulation mit infizierten Fibrozyten ohne Auftrennung in Überstand und Pellet am höchsten (verglichen mit der Stimulation nur mit dem Überstand oder nur mit dem Pellet infizierter Fibrozyten). Besonders deutlich ist das Ergebnis bei CD 83, CD 86, CD 40 und CCR7.
Somit konnte gezeigt werden, dass der virale Vektor EHV-C auf MDDCs ein Cross Priming Potential besitzt. Aber auch der virale Vektor NYVAC-C kann MDDCs maturieren, wenn er die dendritschen Zellen zusammen mit den infizierten Fibrozyten stimuliert. Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, dass Cross Priming eine bessere zelluläre Immunantwort generieren kann. Aber auch NYVAC-C ist in der Lage MDDCs zu maturieren, wenn das Virus nicht direkt, sondern zusammen mit infizierten, teilweise apoptotischen oder nekrotischen Fibrozyten MDDCs stimuliert.
Translation of the abstract (English)
The viral vector EHV is able to infect and to maturate dendritic cells in contrast to the viral vector NYVAC. For that reason there was a special interest in investigating the cross priming potential of EHV-C and NYVAC-C on dendritic cells. On the one hand there would be no need to direct infect dendritic cells in order to generate an adequate cellular immune response. On the other hand there ...
Translation of the abstract (English)
The viral vector EHV is able to infect and to maturate dendritic cells in contrast to the viral vector NYVAC. For that reason there was a special interest in investigating the cross priming potential of EHV-C and NYVAC-C on dendritic cells. On the one hand there would be no need to direct infect dendritic cells in order to generate an adequate cellular immune response. On the other hand there could be built an immune response even against viruses that inhibit the conventional MHC-I-processing. For the viral vector NYVAC it is obvious, that after infection of dendritic cells in vitro there is no maturation. But in vivo as part of a DNA prime/NYVAC boost vaccination the viral vector NYVAC generates a T-cell immune response.
For analysing the cross priming potential of the HIV-vaccines EHV-C and NYVAC-C it was intended to infect a fibrocytelike cell line. After centrifugation their supernatants were used to stimulate monocyte derived dendritic cells (MDDCs). Maturation was detected by measuring maturation markers (CD80, CD83, HLA-DR, CD86, CD40, CCR7) and the production of specific cytokines like IL-6, IL-10, IL-12 and TNF alpha was measured. In addition the maturated MDDCs were incubated with cytotoxic T-cells, that had already contact to the HI-virus. The resulting interferon-γ production was detected by Elispot assay.
First MRC-5 cells were used as infected cell line. However it was shown, that even the supernatant of uninfected MRC-5 cells maturated MDDCs. So an autologous cell culture system was developed using EHV-C and NYVAC-C infected fibrocytes derived from CD14+ cells. Thus there was no maturation of MDDCs by the supernatants of uninfected fibrocytes. Further MDDCs were obviously maturated by the supernatant of EHV-C infected fibrocytes, even better than by direct infection of MDDCs. By trend the analysis of cytokines confirmed theses results. Finally CD8+ T-cells, that were in contact with epitopes of the HI-virus, were stimulated by MDDCs, that were maturated by the supernatants or pellets of infected autologous fibrocytes. Thus the viral vector EHV-B is able to activate cytotoxic T-cells to produce interferon-γ. This shows the cross priming potential of the viral vector EHV. The stimulation with the pellet of NYVAC-B infected fibrocytes leads to a T-cell interferon-γ production as well.
The stimulation of MDDCs with EHV-infected fibrocytes without separation in supernatant or pellet results in the highest expression of maturation markers. Even through stimulation with NYVAC infected fibrocytes there is an obvious expression of matuaration markers implicating a cross priming potential for NYVAC, if used for MDDC stimulation together with apoptotic and necrotic cells.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 15:31
Owner only: item control page
Download Statistics