Untersuchungen zur Infektionseffizienz der HIV-Vakzinekandidaten EHV-C und NYVAC-C in über Monozyten generierten dendritischen Zellen

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	16 January 2014
Referee:	Prof. Dr. Ralf Wagner
Date of exam:	11 June 2013
Institutions:	Medicine > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene
Keywords:	EHV, NYVAC, MDDC, monocyte derived dendritic cells, HIV Vakzine, HIV Impfstoff
Dewey Decimal Classification:	600 Technology > 610 Medical sciences Medicine
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	28385

Abstract (German)

In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe konnte in EHV infizierten MDDCs eine hohe Antigenexpression und Maturation im Gegensatz zu NYVAC infizierten MDDCs gezeigt werden. Ziel dieser Arbeit war es, die Infektionseffizienz, die Expression früher und später Gene und die HIV-Antigenexpression der Vektorsysteme EHV-C und NYVAC-C in MDDCs genauer zu untersuchen. HEK 293T-Zellen dienten als Kontrolle. Die ...

Abstract (German)

In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe konnte in EHV infizierten MDDCs eine hohe Antigenexpression und Maturation im Gegensatz zu NYVAC infizierten MDDCs gezeigt werden.
Ziel dieser Arbeit war es, die Infektionseffizienz, die Expression früher und später Gene und die HIV-Antigenexpression der Vektorsysteme EHV-C und NYVAC-C in MDDCs genauer zu untersuchen. HEK 293T-Zellen dienten als Kontrolle. Die Infektionseffizienz wurde mittels fluoreszenzmarkierter Viren durchgeführt. Fluoreszenzmikroskopische und FACS Analysen zeigten eine deutliche Infektion von MDDCs mit EHV-C (64,1 %) wohingegen NYVAC-C in MDDCs nicht beziehungsweise nur sehr gering (1,9 %) nachgewiesen werden konnte.
Die Transkriptionsanalyse wurde mit den frühen und späten Genen der beiden Vektorsysteme durchgeführt. Hierzu wurden IE als frühes und gpD als spätes Gen von EHV und E3L als frühes und F17R als spätes Gen von NYVAC verwendet. Als Methode diente die reverse Transkription mit anschließender relativer Quantifizierung mittels real-time PCR.
Nach Infektion von MDDCs mit EHV-C kam es auf Transkriptionsebene zur Expression der untersuchten frühen Gene IE, EICP0 und auch des späten Gens gpD. In HEK 293T-Zellen war die Expression dieser Gene dagegen gering. Nach Infektion von MDDCs mit NYVAC-C wurde das untersuchte frühe Gen E3L auf Transkriptionsebene exprimiert, das späte Gen F17R jedoch kaum. Das lässt auf einen Block zwischen der Transkription früher und später Gene von NYVAC-C in MDDCs schließen, möglicherweise während des viralen Replikationszyklus. Dagegen wurden in HEK 293T-Zellen das frühe und das späte Gen exprimiert.
Eine Infektion mit EHV-C führte in MDDCs zu einer stärkeren Transkription und Translation des Gag-Antigens als eine Infektion mit NYVAC-C. Dies konnte sowohl mittels real-time PCR, als auch in der FACS- und Western-Blot-Analyse gezeigt werden.
Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit die Ergebnisse bezüglich der geringen Maturationskapazität und Antigenexpression von NYVAC-C in MDDCs aus den Voruntersuchungen bestätigt werden. Neben der niedrigen Infektionsrate konnte für NYVAC-C in MDDCs ein Block zwischen der Expression früher und später Gene während der Virusreplikation gezeigt werden.

Translation of the abstract (English)

Infection of monocyte derived dendritic cells with the viral vector EHV leads to high antigen expression and maturation compared to infection with the viral vector NYVAC. Therefore studies on the efficiency of infection, the expression of early and late genes and the expression of the HIV antigen gag of the viral vectors EHV-C and NYVAC-C in MDDCs were aim of the research. In order to ...

Translation of the abstract (English)

Infection of monocyte derived dendritic cells with the viral vector EHV leads to high antigen expression and maturation compared to infection with the viral vector NYVAC.
Therefore studies on the efficiency of infection, the expression of early and late genes and the expression of the HIV antigen gag of the viral vectors EHV-C and NYVAC-C in MDDCs were aim of the research.

In order to investigate the efficiency of infection the virus was stained with a fluorescent dye and fluorescence microscopy and flow cytometry were realized. In contrast to NYVAC the viral vector EHV showed obviously some degree of infection.

Transcription analysis was based upon the expression of early and late genes of both viral vectors. The early gene of EHV-C were IE and EICP0, the late was gpD. The early gene of NYVAC was E3L, the late was F17R. Therefore RNA was isolated, and after reverse transcriptation real time PCR with relative quantification was performed. After infection with EHV-C MDDCs show an adequate expression of the early genes IE and EICP0 and the late gene pgD as well. After infection with NYVAC-C MDDCs show an expression of the early gene E3L, but not of the late gene F17R. For NYVAC-C this implicates a block of viral replication between the transcription of early and late genes. Contrary after infection of HEK 293T-cells with NYVAC-C they express early and late genes.

Infection with the viral vector EHV-C leads in MDDCs to a stronger transcription and translation of the HIV Gag antigen compared to an infection with NYVAC-C as shown with real time PCR, flow cytometry and westernblot analysis.

Finally the results regarding the low maturation and antigen expression of NYVAC-C infected MDDCs were confirmed. Besides of the low infection rate of NYVAC-C there was shown a block between the expression of early and late genes during viral replication.

Details

Preview

Export bibliographical data

Abstract (German)

Abstract (German)

Translation of the abstract (English)

Translation of the abstract (English)

Download Statistics

Downloads

More literature (via CORE)

University Library