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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-288475
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 17 October 2013 |
| Referee: | Prof. Dr. Jörg Heilmann |
| Date of exam: | 30 August 2013 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical Biology (Prof. Heilmann) |
| Keywords: | Kava Kava, chalcones, tacrin-silibinin codrug, in vitro hepatotoxicity/hepatoprotection, microsomal metabolism |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 28847 |
Abstract (English)
(1) Kava kava, traditionally used by the Pacific Islanders as a socio-ceremonial beverage and remedy, was approved as an anxiolytic drug in Western countries. However, the reports of severe hepatotoxic side effects led to the withdrawal of kava-containing products in most of these countries. Since then, responsible constituents and possible mechanisms of hepatotoxicity are controversially ...
Abstract (English)
(1) Kava kava, traditionally used by the Pacific Islanders as a socio-ceremonial beverage and remedy, was approved as an anxiolytic drug in Western countries. However, the reports of severe hepatotoxic side effects led to the withdrawal of kava-containing products in most of these countries. Since then, responsible constituents and possible mechanisms of hepatotoxicity are controversially discussed.
To evaluate the hepatotoxic potential of single compounds, six kavalactones were isolated from an acetonic kava root extract and the three kava-chalcones (flavokawains) were obtained by synthesis. Subsequently, these major and minor constituents were tested towards their effects on cell viability and proliferation of human hepatoma cell lines. Whereas the toxicity of five tested kavalactones was found to be very low (K, M, DMY) or completely absent (DHK, DHM), distinct effects on both cell viability and proliferation were observed for the kavalactone Y and the kava-chalcones, FKB being the most toxic (IC50 ~ 30 µM on HepG2 and IC50 ~ 40 µM on HuH-7) of the test compounds.
The results of this study suggest that the flavokawains might contribute to the hepatotoxic potential of kava. Based on obtained in vitro toxicity data, further testing of long-term toxicity of Y and flavokawains is recommended preferably on primary human hepatocytes or in vivo in a suitable animal model.
(2) Therapy options for the treatment of Alzheimer’s disease are still constricted to a few approved drugs. Facing the therapy limiting hepatotoxic side effects of tacrine in a new approach, a tacrine-silibinin codrug was synthesized that showed promising pharmacological properties such as AChE and BChE inhibitory activity in vitro and pro-cognitive effects in vivo in rats.
Driven by these promising results, the in vitro hepatotoxic potential of the codrug was assessed and compared to tacrine and an equimolar mixture of tacrine and silibinin. Therefore, the compounds’ effects on cell number and fluorescence intensity of mitochondria of hepatic stellate cells were investigated. For both, the codrug and the physical mixture, reduced mitotoxicity compared to tacrine was observed. Additionally, the codrug did not show any influence on the cell number up to concentrations of 200 µM. The results correlated well with the findings of the in vivo hepatotoxicity studies in rats. Furthermore, to find first hints of the active principle of the codrug, in vitro stability and microsomal metabolism studies were performed. In the presence of microsomes, the codrug was rapidly cleaved by esterases into tacrine hemi succinamide and silibinin. In phase II metabolism, codrug- and silibininglucuronides were detected. As these metabolites are likely also formed in vivo, they may constitute the active principles of the codrug. Indeed the tacrine hemi succinamide showed pronounced AChE inhibition. Noteworthy, for the codrug cleavage products tacrine hemi succinamide and silibinin, toxicity in the in vitro HSC model was completely absent.
(3) Chalcones possess an interesting pharmacological profile for the treatment of hepatic fibrosis, as they comprise several favorable biological activities such as anti-inflammatory, anti-oxidant, antiviral, and apoptosis-inducing effects. The activation and the perpetuation of this activiation of hepatic stellate cells are considered as the key steps in the pathogenesis of liver fibrosis. Hence, the inhibitory activity of structurally related prenylated and non-prenylated chalcones on activated human hepatic stellate cells was investigated.
With exception of the dihydrochalcones, P, and 3OHHeli, the investigated chalcones had a significant impact on cell viability, proliferation, cell organelles, and cytochrome c release. For the metabolites 4’AcXAN, XANC, and dhXANC, similar activities were found as for the parent compound XAN whereas 4MeXAN and XANH behaved differently. The induction of apoptosis via mitochondrial pathways is suggested as the test chalcones provoked a release of cytochrome c together with altered fluorescence intensity of mitochondria at low concentrations of 10 µM. Several structure elements were identified which enhance or attenuate the activity of chalcones. The double bond in α,β position was essential for the activity. The unprotected hydroxyl group in position C-6’ led to a complete loss of activity in case of P. Prenylation of C-3’ and methoxy-groups in the A ring enhanced the activity whereas substituents in the B ring mostly attenuated the chalcones’ effects. 4’MeXAN, A, and FKB showed the strongest inhibitory effects on HSC. Based on the findings of this study, the most effective chalcones may be chosen to investigate the mechanisms on the molecular level. In addition, toxicity studies on primary human hepatocytes are needed.
(4) For studying the in vitro metabolism of flavokawains and alpinetin chalcone, different microsomal incubation systems were established. LC–HRESIMS was applied to identify phase I and II metabolites and to compile a metabolic profile for these compounds. Obtained data can be used to predict the in vivo metabolism and provide first information about main biotransformation pathways.
Demethylation (C-4, C-4’) and hydroxylation (mainly C-4) constitute the major phase I reactions in flavokawain and A metabolism. FKC is generated as major metabolite of both FKA by demethylation and FKB by hydroxylation in position C-4. Heli is formed as major metabolite of FKC and A after demethylation in position C-4’ and hydroxylation of C-4 respectively. In phase II metabolism, extensive conjugation to glucuronic acid was observed. In combined metabolism, the conjugated metabolites clearly predominated also. Glucuronidation of the parent chalcones is consequently considered as major reaction in the microsomal metabolism of investigated chalcones. The structures of major flavokawain-glucuronides were additionally elucidated using HPLC–NMR techniques. According to the results of this study, the chalcone monoglucuronides may constitute the major metabolites in vivo. It is not known if these metabolites contribute to pharmacological activities of chalcones. Regarding the observed in vitro hepatotoxicity of flavokawains, the biotransformation may also constitute a detoxifying reaction.
Translation of the abstract (German)
(1) Kava Kava, das traditionell auf vielen Pazifischen Inseln als zeremonieller Trunk und Heilmittel verwendet wird, war in westlichen Ländern als angstlösendes pflanzliches Arzneimittel zugelassen. Fallberichte über zum Teil schwerwiegende hepatotoxische Nebenwirkungen führten jedoch zur Marktrücknahme von Kava-haltigen Produkten in den meisten dieser Länder. Seitdem werden die für die Toxizität ...
Translation of the abstract (German)
(1) Kava Kava, das traditionell auf vielen Pazifischen Inseln als zeremonieller Trunk und Heilmittel verwendet wird, war in westlichen Ländern als angstlösendes pflanzliches Arzneimittel zugelassen. Fallberichte über zum Teil schwerwiegende hepatotoxische Nebenwirkungen führten jedoch zur Marktrücknahme von Kava-haltigen Produkten in den meisten dieser Länder. Seitdem werden die für die Toxizität verantwortlichen Inhaltsstoffe und Mechanismen kontrovers diskutiert.
Um das hepatotoxische Potential von einzelnen Inhaltsstoffen zu beurteilen, wurden sechs Kavalactone aus einem acetonischen Kavawurzelstockextrakt isoliert. Drei Kava-Chalkone (Flavokawaine) wurden synthetisiert. Nachfolgend wurde der Einfluss dieser Haupt- bzw. Nebenkomponenten auf die Zellviabilität und –proliferation an humanen Leberkrebszelllinien untersucht. Während für fünf der getesteten Kavalactone eine geringe (K, M, DMY) oder fehlende Toxizität (DHK, DHM) festgestellt wurde, zeigten Y und die Kava-Chalkone deutliche Effekte auf die Zellviabilität und –proliferation. Unter den Testverbindungen wies FKB (IC50 ~ 30 µM an HepG2 und IC50 ~ 40 µM an HuH-7) die höchste Toxizität auf.
Die Ergebnisse deuten auf ein hepatotoxisches Potential der Flavokawaine. Auf Grundlage der in vitro Toxizitätsdaten sollten Langzeittoxizitätstests für Y und die Flavokawaine an primären humanen Hepatozyten oder in vivo, in einem geeigneten Tiermodell, durchgeführt werden.
(2) Die Behandlungsalternativen für Morbus Alzheimer sind immer noch begrenzt auf wenige zugelassene Arzneistoffe. In einem neuen Ansatz wurde versucht, die Therapie-limitierenden hepatotoxischen Nebenwirkungen von Tacrin durch die Synthese eines Tacrin-Silibinin Codrug zu umgehen. Das Codrug zeigte in ersten Tests bereits vielversprechende pharmakologische Eigenschaften wie potente AChE und BChE Hemmung in vitro und auch prokognitive Effekte in vivo in Ratten.
Auf Grundlage dieser positiven Ergebnisse wurde auch die in vitro Hepatotoxizität des Codrug im Vergleich zu Tacrin und einer äquimolaren Mischung aus Tacrin und Silibinin untersucht. Dafür wurde der Einfluss der Verbindungen auf die Zellzahl und die mitochondriale Fluoreszenzintensität an hepatischen Sternzellen untersucht. Sowohl das Codrug als auch die äquimolare Mischung zeigten im Vergleich zu Tacrin eine verminderte Mitotoxizität. Darüber hinaus war für das Codrug kein signifikanter Einfluss auf die Zellzahl bis zu einer Konzentration von 200 µM festzustellen. Diese Ergebnisse korrelierten gut mit den Daten der in vivo Hepatotoxizitätsuntersuchungen in Ratten. Um erste Anhaltspunkte über mögliche aktive Metaboliten des Codrug zu erhalten, wurde außerdem die in vitro Stabilität und die mikrosomale Metabolisierung untersucht. Unter dem Einfluss mikrosomaler Esterasen wurde das Codrug schnell in Tacrinhemisuccinamid und Silibinin gespalten. Als Phase II Metaboliten wurden Codrug- und Silibininglucuronide detektiert. Da diese Metaboliten wahrscheinlich auch in vivo gebildet werden, könnten sie die aktiven Wirksubstanzen des Codrug darstellen. Tatsächlich war auch für das Tacrinhemisuccinamid eine deutliche Inhibition der AChE festzustellen. Darüber hinaus zeigten die Metaboliten Tacrinhemisuccinamid und Silibinin in vitro keinerlei Toxizität im HSC Modell.
(3) Chalkone besitzen ein interessantes pharmakologisches Profil für die Behandlung von Erkrankungen wie der hepatischen Fibrose, da diese Verbindungsklasse eine Reihe günstiger biologischer Aktivitäten umfasst, darunter anti-inflammatorische, anti-oxidative, anti-virale und pro-apoptotische Eigenschaften. Die Aktivierung hepatischer Sternzellen und die Aufrechterhaltung dieses aktivierten Zustandes werden als zentraler Schritte in der Pathogenese der Leberfibrose angesehen. Daher wurde der inhibitorische Einfluss strukturverwandter prenylierter und nicht-prenylierter Chalkone an aktivierten humanen hepatischen Sternzellen untersucht.
Mit Ausnahme der Dihydrochalkone, P und 3OHHeli war für alle getesteten Chalkone ein signifikanter Einfluss auf die Viabilität, Proliferation, Zellorganellen und die Cytochrom c Freisetzung festzustellen. Die Metaboliten 4’AcXAN, XANC und dhXANC zeigten vergleichbare Aktivität zur Ausgangsverbindung XAN, wohingegen 4MeXAN und XANH ein anderes Wirkprofil aufwiesen. Mitochondriale Signalwege scheinen an der Apoptoseinduktion durch die Chalkone beteiligt zu sein, da einige Testverbindungen eine Freisetzung von Cytochrom c zusammen mit einer Verschiebung des mitochondrialen Transmembranpotentials bei bereits 10 µM bewirkten. Einige Strukturmerkmale konnten identifiziert werden, die die Wirkung der Chalkone abschwächen oder verstärken. Die Doppelbindung in α,β Stellung zur Carbonylgruppe stellt ein für die Aktivität essentielles Strukturelement dar. Die ungeschützte Hydroxylgruppe an C-6‘ führte zu einem Aktivitätsverlust im Fall von P. Die Prenylgruppe an C-3‘ sowie Methoxygruppen im A Ring verstärkten die Aktivität, wohingegen B Ring Substitution eher eine Wirkabschwächung der Chalkone bewirkte. 4’MeXAN, A und FKB zeigten die stärkste inhibitorische Aktivität an HSC. Auf Grundlage dieser Erkenntnisse können die potentesten Chalkone für weitere Tests ausgewählt werden um die molekularen Mechanismen der Hemmung aufzuklären. Zusätzlich sollten Toxizitätstests an primären humanen Hepatozyten durchgeführt werden.
(4) Für die Untersuchung der in vitro Metabolisierung der Flavokawaine und Alpinetin Chalkon wurden verschiedene mikrosomale Inkubationssysteme etabliert. Methoden der LC–HRESIMS wurden zur Identifizierung von Phase I und II Metaboliten sowie zur Erstellung eines metabolischen Profils der Ausgangsverbindungen herangezogen. Die erhaltenen Daten können unter anderem zur Vorhersage der in vivo Metabolisierung und der beteiligten Biotransformationswege verwendet werden.
Demethylierung (C-4, C-4‘) und Hydroxylierung (v.a. an C-4) sind die wichtigsten Phase I Reaktionen in der Metabolisierung der Flavokawaine und A. FKC entsteht als Hauptmetabolit von FKA durch Demethylierung und auch von FKB durch Hydroxylierung in Position C-4. Heli ist der Hauptmetabolit von FKC und A nach Demethylierung an C-4‘ bzw. Hydroxylierung an C-4. Als Phase II Reaktion findet in hohem Ausmaß Glucuronidierung statt. Die konjugierten Metaboliten dominierten auch in der kombinierten Metabolisierung. Glucuronidierungsreaktionen können demnach als Hauptmetabolisierungsweg für die untersuchten Chalkone angesehen werden. Die Strukturen der vorherrschenden Flavokawainglucuronide wurden durch Verfahren der HPLC–NMR aufgeklärt. Gestützt auf die Ergebnisse dieser in vitro Studie könnten Chalkonmonoglucuronide auch die Hauptmetaboliten in vivo darstellen. Es ist nicht bekannt, ob diese Metaboliten zu den pharmakologischen Wirkungen der Chalkone beitragen. In Bezug auf die (in vitro) Hepatotoxizität der Flavokawaine könnte die Biotransformation der Chalkone auch eine Entgiftungsreaktion darstellen.
Metadata last modified: 02 Jun 2018 15:20
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