| License: Publishing license for publications including print on demand (6MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-298659
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.29865
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 13 May 2014 |
| Referee: | Prof. Dr. Armin Buschauer |
| Date of exam: | 25 April 2014 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | Gi-Proteine, Gαi3, Autophagie, Leber, Gαi3-defiziente Mäuse, Gi proteins, autophagy, liver, Gαi3-deficient mice |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 29865 |
Abstract (German)
Erkenntnisse über die Regulierung der Signaltransduktion G-Protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCR) sind von enormer Bedeutung im Hinblick auf das Verständnis von Krankheiten und die Entwicklung von Medikamenten. Etwa 25 % der 200 bestverkauften Arzneimittel modulieren die GPCR-Aktivität. G-Proteine, die als Transduktoren die Signale von den GPCRs an intrazelluläre Effektorensysteme weiterleiten, ...
Abstract (German)
Erkenntnisse über die Regulierung der Signaltransduktion G-Protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCR) sind von enormer Bedeutung im Hinblick auf das Verständnis von Krankheiten und die Entwicklung von Medikamenten. Etwa 25 % der 200 bestverkauften Arzneimittel modulieren die GPCR-Aktivität. G-Proteine, die als Transduktoren die Signale von den GPCRs an intrazelluläre Effektorensysteme weiterleiten, besetzen hierbei eine Schlüsselposition in vielen Signalkaskaden u. a. in der autophagischen Proteolyse. Die Autophagie ist ein Prozess, bei dem u. a. Proteine mit Hilfe von Autophagosomen abgebaut werden um eine Energieversorgung des Organismus unter extremen Bedin¬gungen, wie z. B. Nahrungsmangel, sicherzustellen. Eine Vielzahl von Stress¬bedingungen können Autophagie auslösen. So stellen Aminosäuren, Insulin und ATP negative Regulatoren des autophagischen Proteinabbaus dar. Obwohl die präzisen molekularen Mechanismen, die zur Aktivierung und Inhibition der Autophagie führen, größtenteils noch nicht aufgeklärt sind, ist bekannt, dass heterotri¬mere G-Proteine der Pertussistoxin-sensitiven Gi-Familie in der Autophagie involviert sind.
Ein primäres Ziel dieser Arbeit war es daher, die Beteiligung der in der Leber exprimierten Gαi-Proteine, Gαi2 und Gαi3, an der Regulation der hepatischen Autopha¬gie zu charakterisieren, um so grundlegende Einblicke in die Mechanismen der au-tophagischen Proteolyse zu erhalten. Hierzu wurden tierexperimentelle Untersuchungen mit konstitutiv Gi-defizienten Mäusen durchgeführt, sowie Hepatozyten und embryonale Fibroblasten dieser Tiere charakterisiert. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Häussinger wurde die autophagische Aktivität in der Leber mittels in-situ-Leberperfusion untersucht. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass Gαi3, nicht aber das in der Leber quantitativ vorherrschende Gαi2, eine Rolle in der durch In-sulin- und Aminosäure-vermittelten Hemmung der Autophagie spielt.
Um diese Befunde auf die zelluläre Ebene übertragen und weitere Untersuchungen zu den Mechanismen durchführen zu können, wurden experimentelle Werkzeuge wie polyklonale Gαi2- und Gαi3-spezi¬fische Antikörper entwickelt sowie die Isolierung und Kultivierung von murinen Hepatozyten im Labor etabliert. Mit Hilfe dieser Werkzeuge und anhand konfokaler Laserscanning-Mikroskopie konnte erstmals gezeigt werden, dass die subzelluläre Verteilung von Gαi3 vom meta¬bolischen Status der Zelle abhängt. Während Gαi3 unter Nährstoff-reichen Kulturbedin¬gungen diffus in der Zelle verteilt ist, akkumuliert Gαi3 nach Induktion der Autophagie sowohl an der Plasmamembran als auch an LC3-positiven Autophagosomen. Darüber hinaus kolokalisiert Gαi3 teilweise auch mit frühen Endosomen, Lysosomen und mit Teilen des endoplasmatischen Retikulums. Weiterhin wurde mit¬tels subzellulärer Fraktionierung von Mausembryonalfibroblasten und Hepatozyten eine Assoziation von Gαi3 mit Autophagosomen biochemisch überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl Gαi3 als auch Gαi2 erwartungsgemäß in der Plasmamembran-angereicherten Fraktion zu finden sind, dass Gαi3, nicht jedoch Gαi2, außerdem in der Autophagosomen-angereicherten Fraktion nachweisbar war.
Die Serin/Threonin-Kinase mTOR, die einen negativen Regulator in der autopha¬gischen Signalweiterleitung darstellt, ist bei Abwesenheit von Gαi3 dysreguliert. Eine Verteilung von zytoplasmatischem Gαi3 an autophagische Vesikel fand nach Induktion der Autophagie mit dem mTOR Inhibitor Rapamycin nicht statt. Darüber hinaus scheint eine durch Rapamycin induzierte autopha¬gische Proteolyse und somit eine Prozessierung von LC3-I in LC3-II in Abwesenheit von Gαi3 beeinträchtigt zu sein. Diese Daten belegen, dass Gαi3 in die Regulation der durch Nährstoffe- oder Rapamycin-mediierten mTOR-Kinaseaktivität involviert ist. Parallel zu den Untersuchungen auf zellulärer Ebene wurden tierexperimentelle Un¬tersuchungen an Gαi3-defizienten Mäusen sowie eine zweijährige Langzeitbeobachtung von C57BL/6 konstitutiv Gαi3-defizienten sowie Wildtyp-Mäusen durchgeführt. Im Rahmen dieser Studie konnte bei Gαi3-defizienten Mäu¬sen ein im Vergleich zur Kontrollgruppe geringeres Körpergewicht, eine geringere An¬sammlung von Fettgewebe, eine längere Lebenszeit sowie ein früheres Feller¬grauen beobachtet werden. Des Weiteren zeigte sich eine verminderte physische Aktivität von Gαi3-defizienten Mäusen im Vergleich zu wildtypischen Kontrolltieren.
Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass Gαi3 eine obligate Funktion bei der Weiterleitung anti-autophagischer Stimuli signalabwärts von Insulin- und Aminosäure-induzierten Sig¬nalwegen besitzt. Weiterhin hängt die subzelluläre Lo¬kalisierung von Gαi3 vom metabolischen Status der Zellen ab. Dies zeigt, dass Gαi3 eine bisher nicht bekannte Funktion auf autophagosomalen Membranen ausübt.
Translation of the abstract (English)
Insights into the regulation of signaling via G protein-coupled receptors (GPCRs) are of enormous importance in terms of the understanding of diseases and the development of drugs. About 25% of the 200 best-selling drugs modulate GPCR activity. G proteins, which transfer the signals from the GPCRs to intracellular effector systems, have a key position in many signaling cascades amongst others in ...
Translation of the abstract (English)
Insights into the regulation of signaling via G protein-coupled receptors (GPCRs) are of enormous importance in terms of the understanding of diseases and the development of drugs. About 25% of the 200 best-selling drugs modulate GPCR activity. G proteins, which transfer the signals from the GPCRs to intracellular effector systems, have a key position in many signaling cascades amongst others in autophagic proteolysis. Autophagy is a process, in which amongst others, proteins are degraded by autophagosomes to ensure energy supply for the organism under extreme conditions such as food deprivation. A variety of stress conditions can induce autophagy and many signaling pathways are involved in its regulation. Thus amino acids, insulin and ATP are negative regulators of the autophagic protein degradation. Although the precise molecular mechanisms that lead to activation and inhibition of autophagy mostly have not yet been elucidated, it is known that heterotrimeric G proteins of the pertussis toxin sensitive Gi family are involved in autophagy. A primary aim of this work therefore was to characterize the involvement of the Gαi proteins Gαi2 und Gαi3 expressed in the liver in the regulation of hepatic autophagy in order to obtain elementary insights into the mechanisms of autophagic proteolysis. For this, animal studies with constitutive Gi deficient mice have been performed, and hepatocytes and murine embryonic fibroblasts of these animals have been characterized.
In preliminary studies to this thesis the autophagic activity in the liver has been studied by in situ liver perfusion in collaboration with the research group of Prof. Häussinger (Universitätsklinikum Düsseldorf). It could be shown for the first time that Gαi3, but not in the liver quantitatively predominant Gαi2, plays a role in the insulin and amino acid mediated inhibition of autophagy. In order to transmit these findings to the cellular level and to carry out further studies on the mechanisms, experimental tools such as polyclonal Gαi2 and Gαi3 specific antibodies were developed and characterized as well as the establishment of the isolation and culture of murine hepatocytes in the laboratory.
Using these tools and based on confocal laser scanning microscopy it could be demonstrated for the first time that the subcellular distribution of Gαi3 depends on the metabolic state of the cell. While Gαi3 is distributed diffusely in the cell under nutrient rich culture conditions Gαi3 accumulates both to the plasma membrane as well as to LC3 positive autophagosomes upon induction of autophagy. In addition, Gαi3 colocalizes partially with early endosomes, lysosomes and with parts of the endoplasmic reticulum. In an independent approach it was tested biochemically by means of subcellular fractionation of murine embryonic fibroblasts and hepatocytes that both Gαi3 as well as Gαi2 were found in the plasma membrane enriched fraction as expected and that Gαi3, but not Gαi2, was also in autophagosome enriched fraction detectable. In hepatocytes and murine embryonic fibroblasts deficient of Gαi3 it has been shown that the processing of the autophagy marker protein LC3 from cytosolic localized LC3-I form to autophagosome associated LC3-II form is impaired. These results depict a role for Gαi3 in the autophasome formation and fusion. The serine/threonine kinase mTOR, which is a negative regulator in the autophagic signaling is dysregulated in the absence of Gαi3. A distribution of cytoplasmic Gαi3 to autophagic vesicles did not take place after induction of autophagy by the mTOR inhibitor rapamycin. In addition, autophagic proteolysis induced by rapamycin and thus processing of LC3-I into LC3-II seems to be impaired in the absence of Gαi3. These data demonstrate that Gαi3 is involved in the regulation of nutrient or rapamycin mediated mTOR kinase activity. In parallel to the experiments at cellular level experimental analysis with Gαi3 deficient mice have been done as well as a two year longterm observation of C57BL/6 of constitutively Gαi3 deficient and wildtype mice was performed under controlled conditions. In this study, it could be observed that Gαi3 deficient mice had a decreased body weight, a lower accumulation of adipose tissue, a longer lifetime and an earlier onset of the fur turning grey compared to the control group. Furthermore Gαi3 deficient mice revealed reduced physical activity compared to wildtype control animals.
These findings show that Gαi3 has an obligatory role in transducing antiautophagic stimuli downstream of insulin and amino acid induced signaling pathways. Furthermore that the subcellular localization of Gαi3 depends on the metabolic status of the cells and illustrate that Gαi3 exerts an up to date unknown function on autophagosomal membranes.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 01:13
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