| License: Publishing license for publications including print on demand (3MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-300636
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.30063
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 4 June 2014 |
| Referee: | Prof. Dr. Jens Schlossmann |
| Date of exam: | 6 May 2014 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmacology and Toxicology (Prof. Schlossmann, formerly Prof. Seifert) |
| Keywords: | cGMP, cGKII, AQP2, Niere, Sammelrohr |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 30063 |
Abstract (German)
Bei der Protein-Kinasen-vermittelten Signaltransduktion handelt es sich um einen wichtigen Mechanismus, um externe Informationen in Zellen weiterzuleiten und zu verstärken, was nachfolgend zu unterschiedlichen Reaktionen dieser Zellen, abhängig vom extrazellulären Signal (z.B. Hormone wie natriuretische Peptide) und dessen zugehörigem Signalweg, führt. Obwohl die Rolle von natriuretischen ...
Abstract (German)
Bei der Protein-Kinasen-vermittelten Signaltransduktion handelt es sich um einen wichtigen Mechanismus, um externe Informationen in Zellen weiterzuleiten und zu verstärken, was nachfolgend zu unterschiedlichen Reaktionen dieser Zellen, abhängig vom extrazellulären Signal (z.B. Hormone wie natriuretische Peptide) und dessen zugehörigem Signalweg, führt. Obwohl die Rolle von natriuretischen Peptiden, deren second messenger cGMP und dessen Effektoren, der cGMP-abhängigen Proteinkinasen (cGKs), in anderen Organen bereits gut erforscht wurde, existieren bislang nur wenige Hinweise bezüglich cGMP-abhängiger Regulations-Prozesse in der Niere. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deshalb die renale Funktion der cGKII, einer cGK-Isoform, anhand von cGKII-defizienten Mäusen eingehender charakterisiert. Hierzu wurde zunächst ein spezifischer Antikörper generiert, indem der N-terminale Bereich der Kinase in E. coli exprimiert, aufgereinigt und in Kaninchen injiziert wurde. Das entsprechende Antiserum wurde aufgereinigt und mit den erhaltenen Antikörpern im Western Blot die Expression der cGKII in corticalen sowie inner-medullären, schwächer auch in äußer-medullären Strukturen nachgewiesen. Zur Untersuchung der physiologischen Relevanz dieser Expression bezüglich der basalen Nierenfunktion, der forcierten Urin-Aufkonzentrierung sowie der Urin-Verdünnung wurden mit WT- und cGKII-KO-Mäusen unterschiedliche Stoffwechseluntersuchungen in Metabolismus-Käfigen durchgeführt. Hierbei konnten unter normalen sowie unter Renin-stimulatorischen und inhibitorischen Bedingungen bzgl. der ausgeschiedenen Urin- sowie der Kalium-, Natrium- und Chlorid-Mengen im KO lediglich tendenziell Unterschiede zum WT detektiert werden, sodass die cGKII bei der basalen Nierenfunktion nur eine untergeordnete Rolle spielt. Weiterhin konnte eine Beteiligung der Kinase bei der Urinaufkonzentrierung ausgeschlossen werden, untersucht anhand von Durstversuchen sowie weiteren Versuchen, bei denen die orale Applikation einer Salz-Lösung zu einer hypertonen Volumenexpansion führte. Bei der forcierten Urinverdünnung, welche durch Applikation einer hypotonen Lösung (Water Load, WL) induziert wurde, wurde hingegen im cGKII-KO eine signifikante Verminderung der Diurese sowie der Ionenausscheidung, verglichen mit dem WT, detektiert. Da beide Genotypen nach WL eine erhöhte Aldosteronkonzentration im Serum aufwiesen, schien ENaC bei der Verhinderung eines Natriumverlusts infolge des WL eine wichtige Rolle zu spielen. Die veränderte Natriurese im cGKII-KO nach der hypotonen Volumenexpansion ließ sich jedoch nicht eindeutig auf eine gestörte ENaC-Regulation zurückführen. Versuche mit Amilorid zeigten, dass die Unterschiede in der Natriumausscheidung zwischen KO und WT durch die exogene Hemmung von ENaC nicht vollständig aufgehoben werden konnten, so dass hierbei weitere Ionenkanäle beteiligt sein sollten. Zukünftige Untersuchungen werden dazu beitragen, die der veränderten Natriurese zugrundeliegenden, cGMP/cGKII-abhängigen Regulationen des ENaC und weiterer Kanäle zu klären. Indes wurden die Unterschiede in der Diurese im KO eindeutig durch eine erhöhte Expression von Aquaporin 2 in apikalen Plasmamembranen von Sammelrohrzellen und damit einer verstärkten Wasserrückresorption ausgelöst. Die gesteigerte membran-assoziierte AQP2-Expression lag nicht in einer veränderten Phosphorylierung von AQP2 an Ser256 begründet, da selbige in beiden Genotypen nach WL gleichermaßen abnahm. Möglicherweise übt die cGKII eine Funktion bei der Regulation der Endozytose von AQP2 aus und fungiert damit als Gegenregulationsmechanismus zur PKA-vermittelten Exozytose. Eine Interaktion zwischen cGKII und AQP2 und damit möglicherweise eine direkte Phosphorylierung konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht gezeigt werden, so dass bei dieser Regulation auch die Beteiligung weiterer Downstream-Effektoren nicht ausgeschlossen werden kann. Nichtsdestotrotz ermöglicht diese Arbeit einen essenziellen Einblick in renale cGKII-abhängige Signaltransduktionsmechanismen, welche zu einem besseren Verständnis der regulatorischen Grundlagen, die zu einer Urinverdünnung führen, beiträgt. Des Weiteren wird hierdurch erstmals ein Zusammenhang zwischen dem diuretischen und natriuretischen Effekt natriuretischer Peptide und beteiligter intrazellulärer Downstream-Effektoren hergestellt.
Translation of the abstract (English)
Signal transduction by protein kinases is an important mechanism to forward and amplify external information in cells. In turn, the cells respond with various patterns, depending on the extracellular signal (e.g. hormones like natriuretic peptides) and the corresponding signalling pathway. Although the role of natriuretic peptides (inclcluding their second messenger cGMP and its effectors, ...
Translation of the abstract (English)
Signal transduction by protein kinases is an important mechanism to forward and amplify external information in cells. In turn, the cells respond with various patterns, depending on the extracellular signal (e.g. hormones like natriuretic peptides) and the corresponding signalling pathway. Although the role of natriuretic peptides (inclcluding their second messenger cGMP and its effectors, cGMP-dependent kinases (cGKs)) is quite well understood in other vertebrate organs, only a few hints exist regarding the function of these signalling molecules in the kidney. In this thesis, the renal function of cGKII, a cGK isoform, was investigated using cGKII-deficient mice. Therefore, a specific antibody was generated by expression of the N-terminal region of cGKII in E. coli, purification and subsequent injection in rabbits. Using purified antibodies in immuno blots, cGKII was shown to be present in cortical as well as inner-medullary, and, to a lesser extent, in outer-medullary renal sections. Metabolic cage experiments with WT- and cGKII-KO mice were performed in order to investigate the physiological relevance of this expression concerning basal renal function and forced urinary concentration as well as dilution processes. Regarding normal, renin-stimulatory and renin-inhibitory conditions, no significant differences with respect to excreted urine-, potassium-, sodium- and chloride-amounts could be detected between KO- and WT-animals. Consequently, cGKII is involved only to a minor extent in the regulation of basal kidney function. Furthermore, a cGKII-dependent involvement in renal concentration ability could be excluded via starving experiments and via additional experiments, where oral application of a salt solution led to a hypertonic volume load. However, when urinary dilution was forced by application of a hypotonic solution (water load, WL) in cGKII-KO-mice, a significantly lower diuresis and ion excretion was detected compared to water loaded WT-animals. As both genotypes exhibited enhanced blood aldosterone concentrations following WL, it seemed that ENaC could play a prominent role in prevention of a sodium loss due to WL. Albeit, the altered natriuresis following a hypotonic volume expansion could not conclusively be affiliated to an altered regulation of ENaC, since the observed differences in sodium excretion between WT and KO were not completely abolished by co-administration of amiloride, a specific ENaC antagonist. Consequently, further ion channels have to be involved in this complex pathway and future investigations with regard to cGMP/cGKII-dependent regulatory processes are warranted. However, the differences regarding diuresis in cGKII-KO-mice were clearly caused by an enhanced expression of Aquaporin 2 in apical plasma membranes of collecting duct cells resulting in an enhanced water reabsorption. The altered membrane-associated AQP2-expression was not induced by a different phosphorylation of AQP2 at Ser256, because phosphorylation at this site decreased similarly in both genotypes following WL. Apparently, cGKII might exert a function in the regulation of AQP2-endocytosis and serve as a counter-regulatory mechanism to PKA-induced exocytosis. In this work, an interaction between cGKII and AQP2, and therefore a possible direct phosphorylation could not be demonstrated, so that an involvement of further downstream effectors in this regulation cannot be excluded. Nevertheless, this thesis provided crucial insight into cGKII-dependent signalling mechanisms in the kidney regarding dilution processes and relates the diuretic and natriuretic response of natriuretic peptides to intracellular downstream effectors.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 01:04
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