| License: Publishing license for publications excluding print on demand (1MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-303905
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.30390
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 14 July 2014 |
| Referee: | Prof. Dr. Daniela N. Männel |
| Date of exam: | 2 July 2014 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Immunologie |
| Keywords: | Phagozytose, Ficolin, HoxB8 |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 30390 |
Abstract (German)
Das Immunsystem ist ein komplexes Zusammenspiel aus humoralen und zellulären Komponenten. Es besteht aus phylogenetisch komplett verschiedenen Systemen, dem angeborenen und dem erworbenen. Ein Weg der Komplementaktivierung ist der Lektin-Weg mittels Bindung von Mannose-Binding-Lektin oder Ficolin an MASP-2 aktiviert. Ficolin ist ein Protein welches meist aus vier Untereinheiten bestehen welche ...
Abstract (German)
Das Immunsystem ist ein komplexes Zusammenspiel aus humoralen und zellulären Komponenten. Es besteht aus phylogenetisch komplett verschiedenen Systemen, dem angeborenen und dem erworbenen. Ein Weg der Komplementaktivierung ist der Lektin-Weg mittels Bindung von Mannose-Binding-Lektin oder Ficolin an MASP-2 aktiviert. Ficolin ist ein Protein welches meist aus vier Untereinheiten bestehen welche jeweils eine Fibrinogen-like-Domäne und einer Collagen-like-Domäne besitzen. Ficoline gibt es sowohl im humanen System (H-, L-, M-Ficolin) und im murinen System (Ficolin-A und Ficolin-B). Ficoline können mit der Fibrinogen-Like-Domäne zum Beispiel an acetylierte Kohlenhydrate binden und vor kurzem konnten wir zeigen, dass es auch an apoptotische und nekrotische Zellen bindet und diese opsonisiert.
Es gibt verschiedene Möglichkeiten wie pathogene Erreger diesem komplexen System entkommen und so große Infektionen auslösen können. Mit einer Möglichkeit befasst sich die Trojanische-Pferd-Theorie, in der Erreger wie zum Beispiel Staphylococcus aureus, welcher normalerweise ein extrazellulärer Erreger ist, innerhalb von Phagozyten überleben, sich vor Abwehrmechanismen wie Antibiotika und anderen Phagozyten verstecken und dann im gesamten Körper verstreuen lassen können.
Ziel dieser Arbeit war einerseits die Entwicklung eines Phagozytose Assays mittels dem die Trojanische-Pferd-Theorie überprüft werden kann und andererseits die Überprüfung ob Ficolin-B einen Einfluss auf die Phagozytose hat.
Für die Etablierung der Makrophagenphagozytose wurden in der Arbeit einerseits Bone-Marrow-Derived-Macrophages (BMDM) und Peritoneal-Exudate-Cells (PEC) als Makrophagen verwendet. Als Stellvertreter für die potentiell pathologischen Erreger dienten in dieser Arbeit FITC-markierte-Latex-Beads und für die apoptotischen und nekrotischen Zellen wurden COS-Zellen verwendet. Die Apoptose wurde mittels 18kJ-UV-Bestrahlung ausgelöst und die Nekrose mittels 30 Minuten im Wasserbad bei 56°C. Für die Neutrophilenphagozytose wurden die Granulozytenvorläuferzellen HoxB8-Zellen verwendet und zu reifen Neutrophilen diffenrenziert. Die HoxB8-Zellen können mittels PMA (Phorbol-12-Myristat-13-Acetat)/Ionomycin zur erhöhten Expression von Ficolin-B gebracht werden und mit der alleinigen Stimulation durch PMA zum Auswerfen von NET-Formationen (Hunold, 2011).
Es konnte gezeigt werden, dass die Neutrophilenphagzytoserate durch rekombinantes Ficolin-B signifikant gesteigert werden kann. Zuerst wurde überprüft, dass die Neutrophilen die Beads erkennen und phagozytieren. Um das in-vitro Modell der in-vivo Situation anzunähern, wurde die Phagozytose unter Anwesenheit des Komplementsystems anhand von verschiedenen Tierseren getestet. Diese ergaben eine signifikante Steigerung bei Mausserum, jedoch kaum Phagozytose unter dem fetalen Kälberserum. Daher wurde das Modell mit dem Mausserum weiterentwickelt und der Einfluss von Stimulation durch PMA und LPS getestet. Die Anwesenheit von PMA verhindert die Phagozytose der Neutrophilen, dadurch dass alle Neutrophilen ihre NET-Formationen auswerden und kaum Neutrophile noch phagozytieren können. Die Phagozytoserate unter Anwesenheit von Mausserum lässt sich unter LPS nicht mehr signifikant steigern. Unter Anwesenheit von 3% hitzeinaktiviertem Mausserum und 20µg/ml rekombinantem Ficolin-B konnte die Phagozytoserate der Neutrophilen signifikant gesteigert werden.
Als weiteres Modell wurde der Makrophagenphagozytose-Assay von apoptotischen und nekrotischen Zellen entwickelt. Hier konnte trotz Variation der Ficolin-B Menge bis zu 50µg/ml, dem Verwenden von verschieden reifen Makrophagen, wie BMDM und PEC, sowie der Anwesenheit von hitzeinaktiviertem Mausserum keine signifikante Steigerung der Phagozytoserate erreicht werden.
Das letzte Modell wurde die Phagozytose von Neutrophilen durch Makrophagen, in diesem Fall PEC etabliert. Auch hier konnte auch nach verschiedener Stimulation und unter Anwesenheit von Ficolin-B keine signifikante Steigerung erreicht werden.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass rekombinates Ficolin-B die Neutrophilenphagozytoserate signifikant steigen kann. Bei der Makrophagenphagozytose konnte in dieser Arbeit keine signifikante Steigerung erreicht werden
Translation of the abstract (English)
The immune system is a complex interaction of humoral and cellular components. It consists of two, phylogenetic completely different systems, the innate and the adaptive immune system.The complement system can be activated by mannan-binding lectin (MBL) or ficolin, which activates MASP-2(MBL-associated Protease). Ficolin is a protein and consists of four subunits. Those subunits have a ...
Translation of the abstract (English)
The immune system is a complex interaction of humoral and cellular components. It consists of two, phylogenetic completely different systems, the innate and the adaptive immune system.The complement system can be activated by mannan-binding lectin (MBL) or ficolin, which activates MASP-2(MBL-associated Protease).
Ficolin is a protein and consists of four subunits. Those subunits have a fibrinogen-like domain and a collagen-like domain. There is ficolin in the human system (H-, L-,M-ficolin), and also in the murine system (ficolin-A, ficolin-B). Ficolin can bind to N-acetyl carbohydrates and recent studies have shown that ficolin also binds to apoptotic and necrotic cells. This leads to an opsonization of those cells.
Pathogenic microorganisms have developed different ways to escape the complex immune system, causing infections. One possible mechanism is described in the so called trojan-horse-theory. A pathogen like staphylococcus aureus, which is usually located extracellular, can hide from defense mechanisms like antibiotics or other phagocytic cells by hiding within a phagosom. This enables staphylococcus aureus to spread within the organism, causing septicemia.
The aim of this study was the development of a phagocytosis assay to verify the trojan-horse theory and also to assess the influence of ficolin-B on phagocytosis.
To establish macrophage phagocytosis, bone-marrow derived macrophages (BMDM) and peritoneal exudate cells (PEC) were used. FITC-marked latex beads were used to represent the potential pathogenic germ. COS-cells were used for apoptotic and necrotic cells. Apoptosis was induced with 18 kJ ultra-violett radiation, necrosis was induced with a hot water bath at 56°C over 30 minutes. Progenitor granulocyte HoxB8 cells were differentiated to mature neutrophils for the phagocytosis of the neutrophils. The increased expression of ficolin-B by HoxB8 cells was induced with PMA (Phorbol-12-Myristat-13-Acetat)/Ionomycin. The ejection of NET formations, was triggered by PMA stimulation only (Hunold, 2011).
The present study shows, that recombinant ficolin-B can significantly increase the phagocytosis rate of neutrophil granulocytes. The in-vitro model revealed, that neutrophil granulocytes were able to identify and phagocyte latex beads. In order to get closer to in-vivo conditions, phagocytosis was tested in the presence of the complement system from different animal serums. A significant increase of phagocytosis was induced by mouse serum. In contrast, fetal calf serum did not induce an increased phagocytosis. Therefore, we further developed our in-vitro model with mouse serum in order to test the influence of PMA and LPS on stimulation. The presence of PMA inhibits the neutrophil phagocytosis, by causing all neutrophils to eject their NET formations. Therefore, only few neutrophils were able to perform phagocytosis afterwards. There was no significant increase of the phagocytosis rate in mouse serum with LPS. The phagocytosis rate of neutrophil granulocytes could be significantly increased under the presence of 3% heat inactivated mouse serum and 20µg/ml recombinant ficolin B.
As an additional modell, a macophageal phagocytosis assay of apoptotic and necrotic cells was developed.
No significant increase of the phagocytosis rate was achieved, despite an increased amount of ficolin B (up to 50µg/ml), the use of mature macrophages (like BMDM and PEC) and the presence of heat inactivated mouse serum.
The last model, that was developed, was the phagocytosis of neutrophils through PEC macrophages. In this model there was also no significant increase of the phagocytosis rate despite various stimulations under the presence of ficolin-B.
In conclusion, it was possible to show, that recombinant ficolin-B can significantly increase the phagocytosis rate of neutrophil granulocytes. No significant increase, however, was found in the phagocytosis of macrophages.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 01:01
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