| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (6MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-304427
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.30442
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 23 Juli 2014 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Michael Thomm |
| Tag der Prüfung: | 28 Mai 2014 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Mikrobiologie (Archaeenzentrum) > Prof. Dr. Michael Thomm |
| Stichwörter / Keywords: | Argonaute, LSm, small RNA |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 30442 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht, den LSm-Proteinkomplex aus P.furiosus zu reinigen und die oligomere Zusammensetzung des Komplexes zu bestimmen. Das Protein wurde in E.coli exprimiert, über den angefügten His-Tag aufgereinigt und einer analytischen Gelfiltration zugeführt. Durch Gelfiltration wurde ermittelt, dass der LSm-Komplex aus sieben Kopien des Proteins besteht. Außerdem stand das ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht, den LSm-Proteinkomplex aus P.furiosus zu reinigen und die oligomere Zusammensetzung des Komplexes zu bestimmen. Das Protein wurde in E.coli exprimiert, über den angefügten His-Tag aufgereinigt und einer analytischen Gelfiltration zugeführt. Durch Gelfiltration wurde ermittelt, dass der LSm-Komplex aus sieben Kopien des Proteins besteht.
Außerdem stand das archaeelle Argonaute-Protein im Zentrum des Interesses. Das Ago-Protein wurde in P. furiosus exprimiert und anschließend aufgereinigt. Ein anschließender Saccharose-Dichtegradient entschlüsselte PF1848, die 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym-A-Reduktase, als möglichen Interaktionspartner. Dieser könnte bei der Erkennung der guide bzw. target RNA wichtig sein. Für weitere Experimente wurden Argonaute-Antikörper generiert und gereinigt. Es konnte mittels Western-Blot-Analysen gezeigt werden, dass durch die IP-Versuche Argonaute-Proteine sowie hochmolekulare Komplexe präzipitieren. Eine Analyse der mit dem Ago-Protein Co-immunpräzipitierten Nukleinsäuren sollte zeigen, welche Art Nukleinsäure an das Protein band. Durch den Einsatz von RNasen und DNasen konnte somit gezeigt werden, dass es sich um RNA handelte. Diese wurde mit entsprechenden Adaptern versehen, welche eine Sequenzierung ermöglichten. Die Auswertung der Sequenzierungsergebnisse zeigte, dass es sich bei den präzipitierten RNA hauptsächlich um Nukleinsäuren mit einer Länge zwischen 15 und 27 nt handelte, wobei die Moleküle mit 23 nt herausstachen. Die weitere Analyse zeigte, dass es sich bei der sequenzierten RNA vorwiegend um ribosomale RNA handelte, wobei auch einige Treffer im Bereich der sRNA/snoRNA gefunden wurden. Vor allem die durch das Mapping der Sequenzen gegen das P. furiosus erhaltenen sechs Gipfel im 16S rRNA-Bereich fielen auf. Ein Vergleich der Sequenzen dieser sechs Gipfel zeigte deutliche Übereinstimmungen in der Nukleotidabfolge. Zur Validierung der Sequenzierungsergebnisse wurden Northern-Blot-Experimente durchgeführt. Diese zeigten für eine sRNA/snoRNA (snoRNA PFs027A)sowie für die sechs Gipfel im 16S rRNA Bereich (sRNA 16S_1 – sRNA 16S_6) positive Ergebnisse, wohingegen der Nachweis bei 23S sowie 5S rRNA negativ verlief. Die daran anschließenden Interaktionsexperimente bestätigten die Ergebnisse der Northern-Blot-Experimente. So konnte gezeigt werden, dass das Ago-Protein mit der 16S rRNA interagierte. Durch Zugabe von Mg2+-Ionen wurde ein Abbau der 16S rRNA beobachtet. Ähnliche Versuche mit einzelsträngiger RNA sowie doppelsträngiger DNA verliefen negativ. Die sechs bei der Sequenzierung erhaltenen Sequenzgipfel im 16S rRNA Bereich erfuhren eine tiefergehende Untersuchung. So zeigten die seed sequences perfekte bzw. große Übereinstimmungen zu Abschnitten der 16S rRNA. Diese gefundenen Abschnitte wiesen innerhalb der Sekundärstruktur der 16S rRNA alle einen sogenannten loop auf. Diese loop-Struktur ermöglichte es dem Argonaute-Protein mit der 16S rRNA zu interagieren. Nach dem Knock-out des Ago-Proteins in P. furiosus waren die Organismen nicht mehr lebensfähig. Dadurch konnte die wichtige funktionelle Rolle des Proteins unterstrichen werden.
Das Ago-Protein aus P. furiosus ist somit in der Lage, kurze RNA-Abschnitte, welche ihren Ursprung innerhalb der 16S rRNA haben, zu binden. Dieser Komplex interagiert aufgrund der seed sequence dieser RNA-Abschnitte mit der 16S rRNA. Hilfreich hierbei könnte die HMG-CoA-Reduktase sein, welche als Interaktionspartner entschlüsselt wurde. Nach der Interaktion des Argonaute-Proteins mit guide und target RNA findet ein Schneideereignis statt, welches aufgrund der Ähnlichkeit des Ago-Proteins zu den Ribotoxinen äußerst wahrscheinlich ist. Das prokaryotische Ago-Protein ist somit für den spezifischen Abbau der 16S rRNA verantwortlich. Die Abbauprodukte benutzt Ago erneut als guide RNA wodurch der Abbau der 16S rRNA sich dadurch selbst regulieren würde.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Within the scope of this thesis I cleaned up the LSm protein complex from P. furiosus to determine the oligomeric composition of the complex. The protein was expressed in E. coli, purified by the added (appended) His-tag and tested with an analytical gel filtration experiment. I discovered by gel filtration that the LSm complex consists of seven copies of the protein. In addition, the archaeal ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Within the scope of this thesis I cleaned up the LSm protein complex from P. furiosus to determine the oligomeric composition of the complex. The protein was expressed in E. coli, purified by the added (appended) His-tag and tested with an analytical gel filtration experiment. I discovered by gel filtration that the LSm complex consists of seven copies of the protein.
In addition, the archaeal Argonaute protein was in the focus of this work. Ago was expressed in P. furiosus and purified afterwards. A sucrose density gradient decrypted PF1848, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase, as a potential interaction partner. This protein may be important by the recognition of guide and target RNA. For further experiments Argonaute antibodies were generated and purified. It was shown by Western blot analysis that during IP experiments Argonaute proteins and high molecular weight complexes precipitate. An analysis of the co-immunprecipitated nucleic acids should show the nature of the interacting nucleic acid. By the use of RNases and DNases I was able to demonstrate that the interacting nucleic acids were RNAs. These were flanked with adapters, which allowed a subsequent sequencing. Evaluating the sequencing results showed that the precipitated RNA had principally a length of 15 to 27 nt. However the molecules with 23 nt stood clearly out. Further analysis pointed out that the sequenced RNAs were predominantly ribosomal RNAs, whereas some hits in the sRNA / snoRNA areas were found. By mapping the sequences to the P. furiosus genome six peaks in the 16S rRNA were noticed. A sequence comparison of these six peaks showed significant similarities in the nucleotide sequence. For validation of the sequencing results Northern blot experiments were performed. The blot showed positive results for sRNA / snoRNA (snoRNA PF027A) and for the six peaks in the 16S rRNA region (sRNA 16S_1 – sRNA 16S_6), whereas the 23S and 5S rRNA detection was negative. The interaction experiments confirmed subsequently the results of the Northern blot experiments. It was shown that the Argonaute protein interacts with the 16S rRNA. Degradation of the 16S rRNA was observed by the addition of Mg2+-ions. Similar experiments with a single-stranded RNA and double-stranded DNA were negative. On-going investigations with the six 16S rRNA peaks found during sequencing were done. It was revealed that the seed sequences showed perfect or great similarities to parts of the 16S rRNA. All of these sections offered in the secondary structure of the 16S rRNA a so-called loop. This loop structure enabled the Argonaute protein to interaction with the 16S rRNA. After the knock-out of the Ago protein in P. furiosus the organisms were no longer viable. This result underlined the important functional role of the protein.
The P. furiosus Ago protein is thus capable of binding short RNAs, which have their origins in the 16S rRNA. This complex interacts due to the seed sequence of the short RNAs with the 16S rRNA. For this binding event the HMG-CoA reductase could be important, because this reductase was decoded as an interaction partner of the Ago protein. After the interaction of the Argonaute protein with guide and target RNA a cutting event takes place, which is most likely due to the similarity of the Ago protein to the Ribotoxinen. The prokaryotic Argonaute protein is therefore responsible for the specific degradation of the 16S rRNA. The degradation products are used again as a guide RNA and the 16S rRNA would thereby regulate itself.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 00:58
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