| License: Publishing license for publications excluding print on demand (4MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-306973
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.30697
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 18 July 2016 |
| Referee: | Prof. Dr. Frank-Michael Matysik |
| Date of exam: | 17 July 2014 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Instrumentelle Analytik (Prof. Frank-Michael Matysik) |
| Keywords: | Kapillarelektrophorese, 2-dimensionale Trenntechniken, Schnelle Kapillarelektrophorese |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 30697 |
Abstract (English)
Fast capillary electrophoresis (CE) coupled to either electrochemical detection modes or mass spectrometry is a powerful tool for applications like metabolomics or monitoring of fast rate reaction kinetics. Mostly microchip electrophoresis (MCE) has dominated the research on rapid electrophoretic separations since the technique emerged in the early 1990’s. However, the use of short pathway ...
Abstract (English)
Fast capillary electrophoresis (CE) coupled to either electrochemical detection modes or mass spectrometry is a powerful tool for applications like metabolomics or monitoring of fast rate reaction kinetics. Mostly microchip electrophoresis (MCE) has dominated the research on rapid electrophoretic separations since the technique emerged in the early 1990’s. However, the use of short pathway conventional capillaries is starting to gain more interest. The well-characterized fused silica capillaries can add unique features to the field of fast rate CE separations. In the first part of this thesis the capabilities of both conventional CE and MCE for conducting fast and efficient electromigrative separations have been evaluated first hand with either commercially available devices or lab-developed setups offering novel and unique properties.
Firstly, the coupling of MCE with the microextraction technique headspace-single drop microextraction (HS-SDME) was used to monitor the biodegradation process of seafood samples. Five volatile, short-chained aliphatic amines were determined using a His/MES buffer (His/MES ratio of 80:20 at pH 6.6) as background electrolyte (BGE). The separation of the analytes was carried out in a 8.7 cm long separation channel of a PMMA microchip integrating thin-film gold electrodes for capacitively coupled contactless conductivity detection (C4D). A number of characteristics of extraction and determination of target species were optimized and applied to shrimp samples. The compounds were separated within less than 30 s at a field strength of 0.4 kV/cm. The proposed method is simple, quick, presents low levels of waste, works with small sample quantities and is suitable to quantify aliphatic amines in seafood samples like shrimp or fish from where they are naturally developing upon biodegradation.
Secondly, it was an aim to investigate the comparably new CE detection technique of capacitively coupled contactless conductivity detection (C4D). It is an emerging and increasingly mature detection mode for CE or MCE. C4D offers nearly universal detection for charged species and, as the name suggests, no contact with the solutions occurs and hence electrode fouling or unwanted electrode reactions are a minor issue. Apart from the practical experiences gained with MCE-C4D in the previously mentioned project a deeper understanding of C4D was strived for. Two tubular C4D cells with varying proportions have been investigated under focus on their principal analytical features under non-separation and separation conditions in conjunction with liquid chromatography (LC). Furthermore, the properties of the tubular cells were compared to the characteristics of a previously tested thin-layer detection cell. Using a theoretical model, the experimental findings were set in comparison to calculated values. This allowed to a certain degree the modelling of the complex behaviour of C4D detection in combination with LC. Furthermore, the tubular cells were used for the HPLC separation of a model system of organic acids. In comparison to the thin-layer cell, the tubular cells are superior regarding the determined analytical characteristics.
In the next part of the work, the possibilities of achieving highly efficient and very fast (less than 10 s) CE separations on vertically aligned short pathway capillaries with amperometric detection (AD) were investigated. Utilizing a homemade experimental setup it was possible to separate electroactive substances in a non-aqueous BGE in 3s. Extraordinarily high field strengths of up to 3 kV/cm and capillaries of varying inner diameter (ID, ranging from 5 to 50 µm) as short as 4 cm were essential for achieving very fast separations. Furthermore, all parameters regarding the optimal use of AD in this system were investigated and successfully optimized. The vertical alignment allows for construction of titer-plate based devices for true high through-put applications. A sample throughput of theoretically up to 200 separations/hour could be shown.
Based on the experiences with CE on short pathway capillaries and the work with a portable MCE device a novel portable CE device with corresponding control software was developed and constructed. The device features very small overall dimensions (12 x 12 x 24 cm), light-weight (5 kg) and full portability for in-field operation. Furthermore, it enables dual electrochemical detection (ECD) and can be easily coupled to a mass spectrometer. A miniaturized high-voltage source delivers voltages for electrokinetic injection and separation of up to 8 kV. The vertically aligned separation capillaries can be varied in length from 4 to 15 cm and hence application of field strengths as high as 2.6 kV/cm is possible. The autosampling injection unit allows for a high throughput of samples. The power needed to run the device can be drawn completely from 12 V battery packs or a car battery.
In the second part of the thesis, the goal was investigate the CE injection technique of capillary-batch-injection (CBI). So far, the injection efficiency, meaning the ratio of injected sample to actually needed sample volume to perform an injection, in CE is rather poor (10-3 to 10-6). Therefore, an optimized method to carry out fast capillary electrophoresis (CE) with ultrasmall sample volumes (less than 10 nL) was developed. Furthermore, a protocol for quantitative preconcentration of trace compounds in small sample volumes by evaporation of solvent was elaborated and applied to complex sample matrices.
Extremely small sample drops (500 pL) were used to perform a CE injection. An experimental setup comprising a thermoelectric element with cooling unit and a corresponding temperature control device that enables freezing and unfreezing of very small sample volumes was developed. Using sharp-tapered injection capillaries and the precise positioning motors of the CBI-setup, the sample uptake and almost 100% efficient injection of ultrasmall samples into funnelled separation capillaries was successfully achieved. Highly efficient CE-TOF-MS separations of a model system consisting of cyclic nucleotides and nucleotides were done in 23 cm short capillaries (25 µm ID) in less than 50 seconds.
Lastly, a novel way to perform comprehensive 2-D separations was developed by coupling high performance ion chromatography (HPIC) and CE via a modulator unit. The presented system showed for the first time the coupling of IC with CE via a novel microprocessor-controlled modulator. Basically, the two most important techniques for ion separation are coupled via an interface and the complementary nature of their principles can be used to achieve separation of complex bioanalytical or environmental samples. Enhanced overall speed and powerful detection and sensitivity in combination with MS are one of many advantages this system has to offer. Samples comprising nucleotides and cyclic nucleotides were subjected to the system and it could be shown that IC x CE delivers highly efficient separations in cases where the individual separation methods failed to resolve the compounds. All in all, the combination resulted in a strong increase in peak capacity due to the high separation efficiency of CE and due to the orthogonality of IC and CE.
Translation of the abstract (German)
Die Kopplung von schneller Kapillarelektrophorese (CE) mit elektrochemischer Detektion (ECD) oder Massenspektrometrie ist ein interessantes analytisches Instrument, beispielsweise zur kinetischen Charakterisierung von schnellen Reaktionen oder für Metabolomics-Anwendungen. Die Mikrochipelektrophorese (MCE) hat seit ihrer Einführung zu Beginn der 90er Jahre des letzten Jahrhunderts die Forschung ...
Translation of the abstract (German)
Die Kopplung von schneller Kapillarelektrophorese (CE) mit elektrochemischer Detektion (ECD) oder Massenspektrometrie ist ein interessantes analytisches Instrument, beispielsweise zur kinetischen Charakterisierung von schnellen Reaktionen oder für Metabolomics-Anwendungen. Die Mikrochipelektrophorese (MCE) hat seit ihrer Einführung zu Beginn der 90er Jahre des letzten Jahrhunderts die Forschung rund um schnelle elektrophoretische Trennungen beherrscht. Jedoch rückte der Einsatz von kurzen Segmenten klassischer Quarzglaskapillaren kürzlich wieder mehr in den Fokus. Die vollumfänglich charakterisierten Quarzglaskapillaren verfügen über einizigartige Eigenschaften die sehr nützlich für schnelle elektrophoretische Trennungen sind. Der erste Teil dieser Arbeit widmet sich den Möglichkeiten zur Erlangung schneller elektromigrativer Trennungen mittels CE oder MCE mit entweder kommerziell verfügbaren Apparaturen oder selbst entwickelten Geräten, welche über neue und besondere Merkmale verfügen.
Zuerst wurde die Kopplung von MCE mit der miniaturisierten Probenvorbereitungstechnik headspace-single drop microextraction (HS-SDME) zur Verfolgung von biologischen Zerfallsprozessen von Meeresfrüchten untersucht. Fünf leichtflüchtige, kurzkettige aliphatische Amine wurden unter Verwendung einer His/MES-Lösung (im Verhältnis 80:20, pH 6.6) als Hintergrundelektrolyt bestimmt. Die Trennung erfolgte in einem 8.7 cm langen Trennkanal eines PMMA-Mikrofluidik-Chips mit integrierten Dünnschicht-Goldelektroden für die kapazitiv gekoppelte kontaktlose Leitfähigkeitsdetektion (C4D). Eine optimierte Methode zur Trennung wurde entwickelt und schließlich auf Shrimp-Proben angewandt. Die Analyten konnten in weniger als 30 s bei Feldstärken von 0.4 kV/cm getrennt werden. Die vorgeschlagene Methode ist einfach, schnell, erzeugt wenig Abfall, kommt mit geringen Probenmengen aus und ist geeignet um quantitativ aliphatische Amine in Meereserzeugnissen wie Fisch oder Shrimp zu bestimmen.
Zweitens, war es ein erklärtes Ziel die vergleichsweise junge CE-Detektionstechnik der kapazitiv gekoppelten Leitfähigkeitsdetektion (C4D) genauer zu untersuchen. Es handelt sich um einen aufstrebenden und zunehmend ausgereiften Detektionsmodus für CE oder MCE. C4D ermöglicht die nahezu universelle Detektion geladener Spezies und wie der Name schon sagt, erfolgt kein Kontakt mit den Lösungen im Trennkanal. Dies hat den Vorteil, dass Probleme wie Elektrodenabnutzung, Gasblasenentwicklung an der Elektrodenoberfläche oder unvorteilhafte Elektrodenreaktionen eine untergeordnete Rolle spielen. Neben den praktischen Erfahrungen, die während der Arbeit mit MCE-C4D im bereits erwähnten Projekt gewonnen werden konnten wurde ein tieferes Verständnis der Detektionstechnik angestrebt. Zwei zylinderförmige C4D-Zellen mit unterschiedlichen geometrischen Charakteristiken wurden untersucht. Besonderes Augenmerk wurde dabei auf ihre vorrangigen analytischen Merkmale unter Nicht-Trenn- und Trennbedingungen in Kombination mit Flüssig-Chromatographie (LC) gelegt. Darüber hinaus, wurden die beiden zylinderförmigen Zellen mit einer bereits zuvor charakterisierten Dünnschicht-Detektionszelle verglichen. Mit Hilfe eines theoretischen Modells konnten die gefundenen, experimentellen Werte mit berechneten Werten verglichen werden. Dies erlaubte zu einem gewissen Grade die Modellierung des komplexen Verhaltens der C4D-Detektion in Verbindung mit Flüssigchromatographie. Zudem wurden die zylinderförmigen Zellen zur HPLC-Trennung von organischen Säuren eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass die zylinderförmigen Zellen hinsichtlich ihrer analytischen Merkmale der Dünnschicht-Zelle überlegen sind.
Im nächsten Teil der Arbeit wurden die Möglichkeiten zur Erlangung von sehr schnellen (in weniger als 10 s) und hocheffizienten Trennungen in vertikal angeordneten, kurzen Kapillarsegmenten in Kombination mit amperometrischer Detektion (AD) untersucht. Unter Benutzung eines selbstgebauten experimentellen Aufbaus war es möglich elektroaktive Substanzen in 3 s zu trennen. Außerordentlich hohe Feldstärken von bis zu 3 kV/cm und gerade einmal 4 cm lange Kapillaren verschiedener Innendurchmesser (5 bis 50 µm ID) waren entscheidend für die Erreichung besonders schneller Trennungen. Zudem wurden alle Parameter die Einfluss auf den optimalen Gebrauch der amperometrischen Detektion in diesem System hatten untersucht und erfolgreich optimiert. Die platzsparende, vertikale Anordnung erlaubt die Entwicklung von titer-plate basierten Vorrichtungen zur Durchführung von wahren Hochdurchsatz-Anwendungen. Ein Probendurchsatz von theoretischerweise bis zu 200 Proben/Stunde konnte implementiert werden.
Aufbauend auf den Erfahrungen mit CE in kurzen Kapillarstücken und der Arbeit mit dem portablen MCE Gerät wurde ein eigener, neuer tragbarer CE-Apparat mit zugehöriger Kontrollsoftware entwickelt und gebaut. Das Gerät besitzt geringe Gesamtausmaße (12 x 12 x 24 cm), ist besonders leicht (5 kg) und ist für vor-Ort Einsätze geeignet. Zudem verfügt es über doppelte elektrochemische Detektion und kann auch ganz einfach mit der Massenspektrometrie (im Labor) gekoppelt werden. Eine miniaturisierte Hochspannungsquelle liefert Hochspannungen von bis zu 8 kV sowohl für elektrokinetische Injektion als auch die Trennung. Die vertikal angeordneten Trennkapillaren können in ihrer Länge von 4 bis 15 cm variiert werden und somit können Feldstärken bis zu 2.6 kV/cm erreicht werden. Die automatisierte Injektionsvorrichtung ermöglicht hohen Probendurchsatz auf kleinem Raum. Das Gerät bezieht die benötigte Laufleistung entweder aus 12 V Akkupacks, einer Autobatterie oder durch einen 12 V Adapter aus dem Stromnetz.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde das Ziel verfolgt die Anwendungsbreite der neuen CE-Injektionsstrategie Kapillar-Batch-Injektion (CBI) zu erweitern und diese Technik noch genauer zu untersuchen. Dies erfolgte mittels eines, in unserer Gruppe gebauten, automatisierten CBI-Aufbaus. Bisher ist die Injektionseffizienz, definiert als Verhältnis von tatsächlich injizierter Probe zur benötigen Probenmenge um eine Injektion durchzuführen, eher unvorteilhaft (im Bereich von 10-3 bis 10-6). Daher wurde eine optimierte Methode zur Durchführung von schnellen Kapillarelektrophorese-Trennungen mit extrem kleinen zur Verfügung stehenden Probenvolumina entwickelt. Zudem wurde eine Methodik zur quantitativen Aufkonzentrierung von Spurensubstanzen in kleinsten Probenvolumina durch Verdampfung des umliegenden Lösungsmittels entwickelt und auf komplexe Probenumgebungen angewandt.
Extrem kleine Probentropfen (500 pL) konnten für CE Injektionen verwendet werden. Unter Normalbedingungen verdampfen diese kleinen Probemengen sehr schnell. Aus diesem Grunde wurde ein Aufbau bestehend aus thermoelektrischem Element mit zughöriger Kühleinheit und entsprechender Temperaturkontrolleinheit entwickelt und gebaut, welcher es ermöglicht kleinste Probentropfen im CBI-Setup einzufrieren und wieder nach Bedarf aufzutauen. Unter Einsatz von scharf-zugeätzten Injektionskapillaren und mit Hilfe der präzisen Positioniermotoren des CBI-Aufbaus, war es möglich die 100% effiziente Injektion von nL- oder pL-großen Proben in trichterförmig geätzte CE Trennkapillaren durchzuführen. Hocheffiziente CE-TOF-MS Trennungen eines Modellsystems von zyklischen und nicht-zyklischen Nukleotiden in einer 23 cm langen (25 µm ID) in weniger als 50 s konnten durchgeführt werden.
Außerdem wurde ein neuartiger Weg zur Durchführung von 2-dimensionalen Trennungen mittels Kopplung von Ionenchromatographie (HP-IC) und CE entwickelt und evaluiert. Das entwickelte System ermöglichte zum ersten Mal die Kopplung von Ionenchromatographie und Kapillarelektrophorese mittels eines geeigneten und von einem Mikroprozessor gesteuerten Modulators. Die beiden wichtigsten Techniken zur Trennung von Ionen wurden gekoppelt und ihre sich gegenseitig ergänzenden Trennprinzipien konnten ausgenutzt werden um komplizierte bioanalytische Proben zu analysieren. Erhöhte Geschwindigkeit und leistungsstarke Detektion und Empfindlichkeit in Verbindung mit dem Massenspektrometer sind Beispiele für die Vorzüge die dieses System zu bieten hat. Verschiedene Proben von Nukleotiden und zyklischen Nukleotiden wurden mit dem System untersucht und es konnte gezeigt werden, dass IC x CE genau dort sehr effiziente Trennungen liefert, wo die Einzel-Methoden scheitern. Alles in allem ermöglicht die Methodik aufgrund ihrer hohen Trennleistung und der hohen Orthogonalität von IC und CE eine deutliche Steigerung der peak-capacity (verglichen zu den individuellen Trenntechniken).
Metadata last modified: 26 Nov 2020 00:49
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