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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-307037
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.30703
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 21 August 2015 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Wolfgang Dietmaier |
| Tag der Prüfung: | 14 August 2014 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Pathologie |
| Stichwörter / Keywords: | DUSP4, MKP-2, IQGAP2, Maspin, kolorektales Karzinom, colorectal cancer, CRC |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 30703 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Das kolorektale Karzinom (CRC) ist eine Erkrankung, deren Inzidenz in den letzten Jahrzehnten vor allem in den westlichen Industrieländern stark zugenommen hat. Die Entstehungsmechanismen sind insbesondere auf molekularer Ebene komplex und Gegenstand intensiver Forschungsarbeiten. Die vorliegende Dissertation befasst sich mit den von Maspin regulierten Genen DUSP4 (MKP-2) und IQGAP2 im ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Das kolorektale Karzinom (CRC) ist eine Erkrankung, deren Inzidenz in den letzten Jahrzehnten vor allem in den westlichen Industrieländern stark zugenommen hat. Die Entstehungsmechanismen sind insbesondere auf molekularer Ebene komplex und Gegenstand intensiver Forschungsarbeiten. Die vorliegende Dissertation befasst sich mit den von Maspin regulierten Genen DUSP4 (MKP-2) und IQGAP2 im kolorektalen Karzinom. Das Ziel der Arbeit war basierend auf Vorarbeiten mittels molekularbiologischer Methoden Expression und Funktion der Gene beziehungsweise der Proteine näher zu charakterisieren. Dabei sollten Schlussfolgerungen gezogen werden in welcher Form DUSP4 und IQGAP2 die Tumorentwicklung beeinflussen und welche weiteren tumorrelevanten Marker möglicherweise mit DUSP4 und IQGAP2 assoziiert sind.
Die Expression von DUSP4 wurde abhängig vom Probenmaterial anhand von RT-qPCR, Western Blot, Immunhistochemie und Immunzytochemie an CRC-Zelllinien und Patientenmaterial unter Berücksichtigung der Patientendaten untersucht. Die Expressionslevels wurden mit tumorrelevanten Markern korreliert und die Promotormethylierung analysiert. Für funktionelle Studien in vitro wurde DUSP4 in CRC-Zelllinien überexprimiert und der Einfluss auf potentielle Downstream-Targets sowie die Proliferation von Zellen beobachtet. Die Expression von IQGAP2 wurde ebenfalls an CRC-Zelllinien und Patientenmaterial mit Hilfe von RT-qPCR und Western Blot untersucht. Außerdem wurden die Promotormethylierung und die subzelluläre Lokalisation von IQGAP2 in CRC-Zelllinien analysiert. Für funktionelle Studien wurde ein IQGAP2-Expressionsvektor erstellt und IQGAP2 in vitro in CRC-Zelllinien überexprimiert beziehungsweise mittels siRNA Technik supprimiert. Dabei wurde der Einfluss auf potentielle Downstream-Targets sowie Migration und Apoptose von Zellen untersucht. Schließlich wurden auch Maspin-überexprimierende und supprimierende CRC-Zelllinien analysiert, um den regulatorischen Zusammenhang zu IQGAP2 weiter einzugrenzen und den Einfluss von Maspin auf weitere tumorrelevante Gene zu untersuchen.
Diese Arbeit zeigt zum ersten Mal, dass DUSP4 im CRC und CRC-Zelllinien überexprimiert ist. Dabei ist die Expression von DUSP4 in Mikrosatelliten-instabilen kolorektalen Karzinomen signifikant höher als in Mikrosatelliten-stabilen Karzinomen. Zudem korrelierte die DUSP4-Expression mit KRAS- und BRAF-Mutationen. Promotormethylierung konnte als Einfluss auf die DUSP4-Expression im CRC ausgeschlossen werden. Die Überexpression von DUSP4 führte in vitro zur Herunterregulierung von Mismatch Repair Genen (MLH1 und MSH2) in einer MSS-Zelllinie und zur erhöhten Expression von Genen, die in der Kontrolle des Zellzyklus involviert sind (CDC25A, CCND1, EGR1, FOS, MYC und CDKN1A), in einer MSI-Zelllinie. Zudem konnte die Überexpression von DUSP4 in vitro die Proliferation von CRC-Zellen steigern. Die Phosphorylierung von ERK konnte durch die Überexpression von DUSP4 nicht verringert werden. Eine Erklärung für diesen Widerspruch wäre, dass die hohe DUSP4-Expression im CRC eine vergebliche Reaktion der Zellen auf einen aktivierten MAP-Kinase Weg ist. Damit kann die Hypothese aufgestellt werden, dass DUSP4 als wichtiger Wachstumsregulator von CRC-Zellen innerhalb eines MAP-Kinase Feedback Mechanismus agiert. Die Wirkung von DUSP4 lässt sich dabei gut mit der erhöhten Proliferationsrate von MSI-CRCs im Vergleich zu MSS-CRCs vereinen. Ob DUSP4 in diagnostischen oder prädiktiven Zusammenhängen als potenzieller Biomarker eingesetzt werden könnte, bedarf weiterer Studien.
IQGAP2 war im Großteil der untersuchten CRCs und CRC-Zelllinien im Vergleich zu Normalgewebe herunterreguliert. Da eine Hypermethylierung des IQGAP2 Promotors ausgeschlossen werden konnte, liegen der Herunterregulierung von IQGAP2 wahrscheinlich andere molekulare Mechanismen zu Grunde. Subzellulär war IQGAP2 auf Plasmamembranen und verstärkt Zell-Zell Kontakte konzentriert, sowie teilweise mit F-Actin kolokalisiert. Bei der Überexpression beziehungsweise Suppression von IQGAP2 konnte kein Einfluss auf die Transkription von IQGAP1 festgestellt werden. Eine Suppression von IQGAP2 zeigte keine Expressionsänderungen in Genen, die in der Kontrolle des Zellzyklus involviert sind (CDC25A, CCND1, FOS, MYC und CDKN1A). Auch die Apoptose von CRC-Zelllinien konnte durch IQGAP2 Suppression nicht beeinflusst werden. Es konnte jedoch in vitro gezeigt werden, dass IQGAP2 einen negativen Einfluss auf die Migration von Zellen nimmt und damit einen wichtigen Marker für die Tumorentwicklung im CRC darstellen könnte.
Bei der Untersuchung von Maspin-überexprimierenden Klonen konnte mittels Immunfluoreszenz weiter erhärtet werden, dass IQGAP2 von Maspin negativ reguliert wird. IQGAP2 konnte jedoch nicht durch Maspin Suppression induziert werden. Zudem wurde beobachtet, dass die Phosphorylierung von ERK durch Maspin-Überexpression stark erhöht wurde, die Phosphorylierung von AKT durch eine Maspin Überexpression jedoch nicht beeinflusst wird. Dabei konnte ein Einfluss von IQGAP2 auf die Phosphorylierung von ERK und AKT ausgeschlossen werden. Da ERK auch in nicht-transfizierten Zellen deutlich phosphoryliert war, muss noch abschließend geklärt werden, ob Maspin-Überexpression eindeutig die Phosphorylierung von ERK erhöht. Die subzelluläre Lokalisation von β-Catenin war in SW480 Zellen auf den Zellkern konzentriert, wohingegen in Maspin-überexprimierenden Zellen eine gleichmäßige Verteilung von β-Catenin in Zytoplasma und Zellkern beobachtet wurde. Dabei war die Expression von β-Catenin in SW480 und Maspin-überexprimierenden Zellen gleich hoch. Maspin könnte in CRC-Zellen also den Transport von β-Catenin vom Zellkern ins Zytoplasma beeinflussen. Der EMT-Marker E-Cadherin konnte weder in Maspin-überexprimierenden SW480 und Kontrollen noch in Maspin-supprimierten SW48 und deren Kontrollen nachgewiesen werden. Allerdings konnte die Vimentin-Expression durch Maspin-Überexpression stark reduziert werden. Eine Maspin-Suppression konnte die Vimentin-Expression jedoch nicht induzieren.
Zusammenfassend kann angenommen werden, dass DUSP4 im kolorektalen Karzinom mit Mikrosatelliteninstabilität assoziiert ist, die Proliferation von CRC-Zellen in vitro anregt und als wichtiger Regulator des MAP-Kinase Signalwegs agiert. IQGAP2 entfaltet im kolorektalen Karzinom Tumor-hemmende Wirkungen. Es reguliert die Migration von CRC-Zellen in vitro negativ und wird selbst negativ von Maspin reguliert. Maspin steigert die möglicherweise die Phosphorylierung von ERK, beeinflusst die subzelluläre Lokalisation von β-Catenin und supprimiert die Expression von Vimentin. Die Untersuchungen dieser Arbeit deuten also darauf hin, dass DUSP4, IQGAP2 und Maspin wichtige molekulare Funktionen in der Entwicklung des kolorektalen Karzinoms übernehmen.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
During the last decades the incidences of colorectal cancer (CRC) have increased especially in western industrial countries. The underlying mechanisms of the development of CRC are complex and subject to intense research. This dissertation addresses the Maspin-regulated Genes DUSP4 (MKP-2) and IQGAP2 in colorectal cancer. The aim of this study was the analysis of expression and function of the ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
During the last decades the incidences of colorectal cancer (CRC) have increased especially in western industrial countries. The underlying mechanisms of the development of CRC are complex and subject to intense research. This dissertation addresses the Maspin-regulated Genes DUSP4 (MKP-2) and IQGAP2 in colorectal cancer. The aim of this study was the analysis of expression and function of the genes and their proteins using molecular biologic methods. Consequently, conclusions should be drawn how DUSP4 and IQGAP2 exert influence on tumor development and which other tumor-relevant markers may be associated with DUSP4 and IQGAP2.
Expression of DUSP4 was examined in CRC cell lines and CRC patient samples using RT-qPCR, Western Blot, immunohistochemistry and immunocytochemistry depending on sample material. The expression levels were correlated with tumor-relevant markers and promoter methylation was analyzed. For functional in vitro studies DUSP4 was overexpressed in CRC cell lines and the influence on potential downstream-targets and cellular proliferation was observed. Expression of IQGAP2 was also measured in CRC cell lines and patient samples using RT-qPCR and Western Blot. Furthermore, promoter methylation and subcellular localization of IQGAP2 were analyzed in CRC cell lines. For functional studies an IQGAP2 expression vector was constructed for overexpression and siRNA technology was used to silence IQGAP2 in CRC cell lines in vitro. The influence on potential downstream-targets, cellular migration and apoptosis was investigated. Furthermore, Maspin-overexpressing and Maspin-suppressed CRC cell lines were examined to investigate a regulatory connection between Maspin and IQGAP2 as well as an influence of Maspin on tumor-relevant genes.
This thesis shows for the first time that DUSP4 is overexpressed in CRC and CRC cell lines. The expression levels of DUSP4 were significantly higher in microsatellite-unstable (MSI) CRCs compared to microsatellite-stable (MSS) CRCs. Moreover, DUSP4 expression correlated with KRAS and BRAF mutations. Promoter methylation could be excluded as an influence on DUSP4 expression in CRC. In vitro overexpression of DUSP4 caused downregulation of mismatch repair genes (MLH1 and MSH2) in an MSS cell line and upregulation in genes involved in cell cycle regulation (CDC25A, CCND1, EGR1, FOS, MYC and CDKN1A) in an MSI cell line. Furthermore, overexpression of DUSP4 in vitro could enhance proliferation of CRC cells, whereas ERK phosphorylation was not reduced by overexpression of DUSP4. An explanation for these conflicting data could be that elevated DUSP4 expression in CRC is a futile reaction of cells on an activated MAP kinase pathway. Hence, the hypothesis can be made that DUSP4 acts as an important growth regulator in CRC cells within a MAP kinase feedback mechanism. The effect of DUSP4 fits well to the higher proliferation rates of MSI-CRCs compared to MSS-CRCs. If DUSP4 can be introduced as a biomarker for diagnostic or predictive purposes, remains to be further clarified.
IQGAP2 was downregulated in the majority of CRCs and CRC cell lines compared to normal tissue. Since hypermethylation of the IQGAP2 promoter could be excluded, downregulation may be caused by other molecular mechanisms. Subcellular localization of IQGAP2 was observed in cellular plasma membranes and more intensified in regions of cell-cell contacts. Furthermore, it was partially colocalized with F-Actin. No transcriptional change of IQGAP1 could be observed after IQGAP2 overexpression or suppression. Expression of genes involved in cell cycle control (CDC25A, CCND1, FOS, MYC and CDKN1A) was not affected by IQGAP2 suppression. Also cellular apoptosis was not influenced by IQGAP2 suppression. However, functional migration assays showed that IQGAP2 negatively regulates cellular migration in vitro. Hence, IQGAP2 may act as an important marker for tumor development in CRC.
Using immunofluorescence it could be further proven that IQGAP2 is negatively regulated by Maspin-overexpressing clones. However, IQGAP2 expression was not induced in Maspin-suppressed cells. Furthermore, it was observed that ERK phosphorylation was increased in Maspin-overexpressing cells, whereas AKT phosphorylation was not affected. An influence of IQGAP2 on phosphorylation of ERK or AKT could be excluded. Since ERK was also clearly phosphorylated in non-transfected cells, it has to be further clarified if Maspin overexpression causes increased ERK phosphorylation. Subcellular localization of β-Catenin was concentrated on the nucleus in SW480 cells, whereas Maspin-overexpressing cells showed even distribution of β-Catenin in cellular nucleus and cytoplasm. Additionally, equal amounts of β-Catenin expression in SW480 cells and Maspin-overexpressing cells were detected. Therefore Maspin could exert influence on β-Catenin transport from cellular nucleus to the cytoplasm. EMT-marker E-Cadherin was neither detected in Maspin-overexpressing SW480 and controls nor in Maspin suppressing SW48 and controls. However, expression of Vimentin was strongly downregulated by Maspin overexpression, whereas Maspin suppression could not induce Vimentin expression.
In summary, it can be stated that DUSP4 may be associated with microsatellite instability in colorectal cancer. Furthermore, it enhances cellular proliferation of CRC cells in vitro and acts as an important regulator of the MAP kinase pathway. IQGAP2 acts in a tumor suppressing way in colorectal cancer. It negatively regulates migration in CRC cells in vitro and is negatively regulated by Maspin. Maspin may increase ERK phosphorylation, influences the subcellular localization of β-Catenin and suppresses Vimentin. This study indicates that DUSP4, IQGAP2 and Maspin undertake important molecular functions in the development of colorectal cancer.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 00:48
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