Transcription in Archaea relies on a eukaryotic-like transcription machinery composed of general transcription factors, the RNAP and corresponding promoter elements. In contrast, the regulation of archaeal gene expression depends on bacterial-like transcription factors. In the present work the gene regulatory networks of several archaeal transcription factors from the hyperthermophilic ...
Zusammenfassung (Englisch)
Transcription in Archaea relies on a eukaryotic-like transcription machinery composed of general transcription factors, the RNAP and corresponding promoter elements. In contrast, the regulation of archaeal gene expression depends on bacterial-like transcription factors. In the present work the gene regulatory networks of several archaeal transcription factors from the hyperthermophilic euryarchaeon P. furiosus were examined by ChIP. Moreover, combining ChIP with high-throughput sequencing (ChIP-seq) enabled the first time genome-wide TF binding site mapping in P. furiosus. ChIP-seq revealed that the global regulator of sugar metabolism in P. furiosus, TrmBL1, not only represses and activates expression of sugar-uptake-, glycolysis- and gluconeogenesis-specific-enzymes encoding genes as proposed, but it also controls transcription of genes encoding proteins catalyzing proteolysis, AA metabolism and nucleotide degradation. In addition, TrmBL1 indirectly affects expression of genes involved in functionally-linked metabolic pathways by transcriptional repression of the hitherto not well-characterized secondary transcription factor PF1476. In contrast, the anti-TrmB antibodies were not specific enough to allow investigation of the proposed co-regulation of TrmB and TrmBL1 in sugar metabolism. Furthermore, the genes encoding TrmB and the TM-system were deleted in the P. furiosus type strain. After successfull establishment of the ChIP-seq approach, genome-wide TF binding site mapping was extended to analyze a third paralogous TrmB protein designated as TrmBL2. These studies uncovered numerous potential functions of the TF as both architectural abundant DNA binding protein and global transcriptional regulator in P. furiosus. Furthermore, TrmBL2 ChIP-seq analysis using P. furiosus cells incubated at 107° for 30 min revealed a novel unexpected role of the protein in the heat shock response. TFB-RF1 functions as transcriptional activator by recruitment of TFB to an imperfect BRE. Under optimal growth conditions expression of TFB-RF1 is not detectable and the transcription factor had to be over expressed from the fbpase promoter. First combination of ChIP-seq with the recently developed in vivo over-expression system of P. furiosus confirmed binding of the TF to its in vitro designated binding site in vivo. However, no additional binding sites were identified, which would elucidate a physiological function as regulator. The presented studies of this work contribute to a better understanding of the mechanisms of transcriptional control mediated by gene regulatory networks to achieve optimal growth of the cells in response to differing environmental as well as intracellular conditions.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die Transkription in Archaeen beruht auf einem dem eukaryotischem System ähnlichen Transkriptionsapparat bestehend aus allgemeinen Transkriptionsfaktoren, der RNA Polymerase und den entsprechenden Promotorelementen. Im Gegensatz dazu wird die archaeelle Genexpression vor allem von Transkriptionsfaktoren reguliert, die dem bakteriellen System ähnlich sind. In dieser Studie wurden die ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die Transkription in Archaeen beruht auf einem dem eukaryotischem System ähnlichen Transkriptionsapparat bestehend aus allgemeinen Transkriptionsfaktoren, der RNA Polymerase und den entsprechenden Promotorelementen. Im Gegensatz dazu wird die archaeelle Genexpression vor allem von Transkriptionsfaktoren reguliert, die dem bakteriellen System ähnlich sind. In dieser Studie wurden die genregulatorischen Netzwerke von mehreren archaeelen Transkriptionsfaktoren aus dem hyperthermophilen Modelorganismus P. furiosus durch Etablierung von ChIP Experimenten untersucht. Die Kombination von ChIP Experimenten mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-Seq) ermöglichte zum ersten Mal die Identifizierung von Bindestellen des jeweiligen Transkriptionsfaktors im gesamten Genom von P. furiosus. Im ersten Teil der Arbeit konnte durch ChIP-Seq nachgewiesen werden, dass der globale Regulator des P. furiosus Zuckerstoffwechsels, TrmBL1, nicht nur wie bekannt die Expression von Genen reprimiert und aktiviert, die Zuckeraufnahme-, Glykolyse und Glukoneogenese-spezifische Enzyme kodieren, sondern auch von Genen, die Proteine kodieren, die an der Proteolyse, dem Aminosäurestoffechsel und der Degradierung von Nukleotiden beteiligt sind. Zudem beeinflusst TrmBL1 durch Repremierung der Genexpression des bis jetzt noch nicht intensiv charakterisierten Regulators PF1476 die Transkription von Genen, die an funktionell-verbundenenen metabolischen Prozessen beteiligt sind. Eine Analyse der vermuteten Ko-Regulation des Zuckerstoffwechsels durch die zwei paralogen P. furiosus TrmB Proteine TrmB und TrmBL1 konnte sowohl aufgrund der Kreuzreaktivität der TrmB spezifischen Antikörper mit TrmBL1 als auch aufgrund der genomischen Deletion des Genes, das für TrmB kodiert, nicht durchgeführt werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die ChIP-Seq Experimente auf eine Untersuchung der Funktion eines dritten paralogen TrmB Proteins, TrmBL2, ausgeweitet. Diese Versuche deckten zahlreiche potentielle Funktionen dieses Transkriptionsfaktors als sowohl strukturgebendes chromosomales DNA Bindeprotein als auch als globaler Transkriptions-regulator auf. Zudem wurde eine bis dato unbekannte und unerwartete Beteiligung von TrmBL2 an der Hitzeschockantwort von P. furiosus gefunden. Zusätzlich ermöglichte die erstmalige Kombination von ChIP-Seq Experimenten mit dem kürzlich entwickelten in vivo Überexpressionssystem in P. furiosus eine Charakterisierung von TFB-RF1 in vivo. Dieser fungiert als Aktivator der Transkription durch Stimulierung der Rekrutierung von TFB zum Promotor-TBP-Komplex. Unter normalen Wachstums-bedingungen ist TFB-RF1 nur schwach bzw. gar nicht exprimiert, was eine Induktion der Expression erforderte. Durch die Kombination beider Ansätze konnte die Bindung von TFB-RF1 an die in vitro bestimmte Bindestelle im Genom in vivo bestätigt werden. Es konnten jedoch keine weiteren Bindestellen nachgewiesen werden, die zur Aufklärung der physiologischen Funktion dieses außergewöhnlich archaeellen Aktivators beitragen könnten. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse tragen zu einem besseren Verständnis der durch genregulatorische Netzwerke vermittelten Transkriptionsregulation bei, die ein optimales Zellwachstum unter sich verändernden Umweltbedingungen ermöglicht.
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