URN zum Zitieren dieses Dokuments: urn:nbn:de:bvb:355-epub-312079
Gindner, Antonia
(2015)
Charakterisierung der Transkriptionsregulatoren TrmB und TrmBL1 im Metabolismus des Archaeons Pyrococcus furiosus.
Dissertation, Universität Regensburg.
Zusammenfassung (Deutsch)
Die Hypothese zur differenziellen Bindefähigkeit von TrmB und TrmBL1 an den TM- und MD-Promotor via verschiedener Bindehelices konnte durch in vitro Transkriptionen mit Proteinen, in denen die beiden betroffenen Helices vertauscht wurden, nur für den TM-Promotor bestätigt werden. Für den MD-Promotor blieben die erwarteten Resultate aus oder trafen nur bedingt zu. Aufgrund neuerer Strukturdaten zu ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Die Hypothese zur differenziellen Bindefähigkeit von TrmB und TrmBL1 an den TM- und MD-Promotor via verschiedener Bindehelices konnte durch in vitro Transkriptionen mit Proteinen, in denen die beiden betroffenen Helices vertauscht wurden, nur für den TM-Promotor bestätigt werden. Für den MD-Promotor blieben die erwarteten Resultate aus oder trafen nur bedingt zu. Aufgrund neuerer Strukturdaten zu TrmB wird nun vermutet, dass eine Regulation der beiden Promotoren nicht über verschiedene Helices stattfindet, sondern eher auf den verschiedenen Konformationen der Proteine beruht. Nähere Daten dazu sind jedoch bisher nicht bekannt.
Mit Hilfe des an diesem Lehrstuhl von Frau Dr. Ingrid Waege etablierten Systems wurde eine Simvastatinresistenzkassette in Pyrococcus furiosus eingebracht sowie eine TrmBL1-Deletionsmutante mit der gleichen Antibiotikaresistenz erstellt. Anschließend wurde das Wachstumsverhalten der trmBL1-Deletionsmutante gegenüber dem Simvastatin-resistenten Wildtyp in 1/2-SME-Medium mit je 0,1 % Stärke, Hefeextrakt und Pyruvat untersucht. Dieses zeigte keine Unterschiede der beiden Stämme. Sowohl der Wildtyp als auch die Deletionsmutante vermehrten sich mit nahezu gleicher Wachstumsrate und erreichten annähernd gleiche Zelldichten. Durch ChIP-Seq-Versuch von Robert Reichelt wurde im Laufe dieser Arbeit jedoch festgestellt, dass der als Wildtyp bezeichnete Stamm eine Deletion der Gene pf1737 bis pf1751 besitzt. Somit ist auch das Gen für TrmB deletiert. Der "Wildtyp"-Stamm ist daher bereits eine trmB-Deletionsmutante und die neu etablierte trmBL1-Deletionsmutante somit eine Doppelmutante. Umso erstaunlicher ist, dass unter den in dieser Arbeit verwendeten Bedingungen trotzdem kein Unterschied im Wachstums-verhalten festgestellt werden konnte. Nur ein Vergleich der Phänotypen zeigt, dass die Doppelmutante kleinere Zellen hervorbringt. Weitere Versuche mit veränderten Medienkompositionen könnten hier einen entscheidenden Unterschied im Wachstumsverhalten bringen.
In dieser Arbeit durchgeführte in vitro Versuche zur Regulation durch TrmBL1 an neu gefundenen Promotoren konnten bestätigen, dass TrmBL1 auch an der Regulation des Metabolismus außerhalb des Zuckerstoffwechsels beteiligt ist. In EMSA-Experimenten konnte eine Bindung von TrmBL1 an alle Promotoren, bei denen auch in vivo eine Bindung gefunden wurde, nachgewiesen werden. Zudem konnte an allen getesteten Promotoren (bis auf pf0287 und pf0648 mit einem TGM stromaufwärts der BRE/TATA-Box) in vitro eine Hemmung oder Aktivierung der Transkription gefunden werden. Auch das bereits bekannte Schema mit Bindung an das TGM und die nach dessen Lage daraus resultierende Aktivierung oder Repression der Transkription durch TrmBL1 konnte an den Promotoren nachgewiesen und durch DNaseI Footprinting Analysen die Wichtigkeit des TGM an der Regulation der Promotoren bekräftigt werden.
Bei der Untersuchung des vermuteten Transkriptionsfaktors aMBF1 konnte in EMSA-Versuchen festgestellt werden, dass keine direkte Bindung von aMBF1 an die DNA erfolgt. Erste in vitro Transkriptionsversuche mit dem Transkriptionsfaktor ergaben jedoch, dass dieser durchaus in der Lage ist, die Transkriptionsaktivität zu steigern. An manchen Promotoren sogar um das 2,7-fache der basalen Transkriptionsaktivität. Die Hypothese, dass aMBF1 durch Wechselwirkung mit TrmBL1 an der Aktivierung der Transkription von Promotoren mit TGM stromaufwärts der BRE/TATA-Box beteiligt ist, konnte jedoch nicht bestätigt werden.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The hypothesis of TrmB and TrmBL1 binding with different helices to the TM and MD promoter could only be proven for the TM promoter. The expected results of the mutated proteins with switched binding helices could be shown at the MD promoter just partly, if at all. New structural data of the TrmB protein also suggest a different regulatory mechanism which is based on conformational changes. ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The hypothesis of TrmB and TrmBL1 binding with different helices to the TM and MD promoter could only be proven for the TM promoter. The expected results of the mutated proteins with switched binding helices could be shown at the MD promoter just partly, if at all. New structural data of the TrmB protein also suggest a different regulatory mechanism which is based on conformational changes. Further details are unknown at the moment.
A simvastatin resistant Pyrococcus furiosus wildtype clone and a simvastatin resistant TrmBL1 knockout mutant was successfully created via Dr. Ingrid Waege's system. Its growth was analyzed on 1/2 SME medium containing 0.1 % starch, yeast extract and pyruvate, respectively. Growing curves of the simvastatin resistant wildtype compared with the knockout mutant showed an almost identical growth rate and similar cell densities. ChIP-Seq analysis of Robert Reichelt revealed a deletion of the genes pf1737 to pf1751. Therefore also the gene for TrmB is deleted. That means, the wildtype stem is also a knockout mutant and the new established trmBL1 knockout mutant is therefore a mutated double knockout. Even more surprising is the fact that under the tested conditions no difference in growth could be observed. Just a comparison of the two phenotypes revealed a smaller cell size of the double knockout mutant. Further experiments with altered media could show an important difference in growth behavior.
Indeed, this thesis shows that TrmBL1 is part of a regulatory mechanism beyond sugar metabolism. EMSA experiments showed a binding of TrmBL1 to all promoters which were found in vivo. Furthermore, a repression or activation of transcription by TrmBL1 could be shown at all tested promoters in vitro (excluding pf0287 and pf0648 with a TGM upstream of the BRE/TATA-box). Nevertheless, the distinct pattern of TrmBL1 binding to the TGM and its effect on activation or repression of transcription could be shown for all promoters and DNaseI footprinting analysis could confirm the importance of the TGM for their regulation.
Studies with the assumed transcription factor aMBF1 showed no direct binding of aMBF1 to DNA in EMSA experiments. Nevertheless, first in vitro transcriptions with aMBF1 led to an increased activity at all tested promoters, to some extend even 2.7-fold the amount compared to basal transcription activity. The hypothesis of aMBF1 interacting with TrmBL1 to activate transcription at promoters with TGM upstream of the BRE/TATA-box could not be proven.
Bibliographische Daten exportieren
Downloadstatistik