| License: Publishing license for publications excluding print on demand (5MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-314831
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.31483
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 2 March 2016 |
| Referee: | Prof. Dr. Burkhard König |
| Date of exam: | 6 March 2015 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Organische Chemie > Lehrstuhl Prof. Dr. Burkhard König |
| Keywords: | liposomes, vesicles, surface functionalization, hydrogen bonding, click chemistry, molecular recognition, chemosensors, aptasensors, aptamers |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 31483 |
Abstract (English)
Within the scope of this thesis, a method for the quick and versatile functionalization of preformed liposomes was developed. Further investigations demonstrated the applicability of the obtained vesicular sensors in analytics. Chapter I briefly introduces the concept of functionalized vesicles and its use for analytical applications. In this context, some established assay formats for the ...
Abstract (English)
Within the scope of this thesis, a method for the quick and versatile functionalization of preformed liposomes was developed. Further investigations demonstrated the applicability of the obtained vesicular sensors in analytics.
Chapter I briefly introduces the concept of functionalized vesicles and its use for analytical applications. In this context, some established assay formats for the quantification of receptor–target binding at vesicular membranes are highlighted.
Chapter II deals with hydrogen bonding at phospholipid membranes. Those interactions were initially intended to be utilized for the non-covalent attachment of receptors at vesicles surfaces. Studies on basis of melamine–barbiturate pairs demonstrated that the supposed unique physico-chemical properties at the lipid–water interface are not sufficient to result in stable monovalent complexes. However, cooperative hydrogen bonding at vesicular membranes could be achieved by exploiting concentration-dependent phase separation processes in gel phase phospholipid bilayers. The resulting densely packed clusters of membrane-embedded amphiphilic melamines allowed multisite binding to complementary hexavalent thymidine oligonucleotides.
Due to the observed inefficiency of hydrogen bonding at liposomal surfaces, the focus of research was shifted towards a covalent modification of phospholipid membranes by employing thiol-based click reactions. Chapters III and IV illustrate the development of that technique. Initial studies in view of utilizing a radical thiol–ene coupling are summarized in Chapter IV. This UV light-induced reaction would provide a possibility to temporally control the functionalization process. It was found that radical thiol–ene additions are not efficient in the micromolar concentration range in aqueous solution and thus, their applicability for the post-functionalization of vesicle surfaces is very limited. The nucleophilic version employing a thiol–maleimide system, however, turned out to fulfill the requirements for the intended strategy. Based on this, surface-reactive luminescent vesicles were prepared by self-assembly of phospholipids, amphiphilic maleimides and fluorophores in aqueous solution (Chapter III). Those preformed liposomes were functionalized with various thiolated receptor units such as a bis-Zn2+-cyclen derivative for the detection of phosphate moieties or a DNA aptamer for specific interactions with the antibiotic ampicillin. The obtained receptor-modified vesicles indicated the binding of the targets to their surface by changes of the fluorescence emission properties of the membrane co-embedded carboxyfluorescein dyes. The post-functionalization concept could also be used for molecular imprinting of vesicle surfaces. The template-guided patterning of receptors based on bis-Zn2+-cyclen resulted in fluorescent sensors suitable for the specific recognition of a bivalent peptide.
In Chapter V, the versatile applicability of the post-functionalization strategy of vesicles is demonstrated by extension to a thrombin-binding aptamer as further recognition element. The resulting aptasensors signaled the high-affinity binding of the analyte to the liposome surface again by dynamic changes of the emission properties of membrane-embedded fluorescent reporter dyes. Here, the sensing of thrombin was achieved within its physiological concentration range.
In conclusion, the presented functionalization method of preformed liposomes allows an easy, fast and inexpensive access to various supramolecular sensors. Due to the highly modular approach, a simple variation of the receptor–fluorophore combinations can be accomplished. An extension of that technique to recognition elements such as peptides, other oligonucleotides or complex macromolecules may be envisaged, which could facilitate the development of novel customized devices for bioanalytical applications.
Translation of the abstract (German)
Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurde eine Methode zur schnellen und vielseitigen Funktionalisierung von „Liposomenrohlingen“ entwickelt. Weitere Untersuchungen veranschaulichten die Eignung der so erzeugten Sensorvesikel in der Analytik. Kapitel I liefert eine kurze Einführung in das Konzept der funktionalisierten Vesikel und erläutert dessen Einsatzmöglichkeit im Rahmen von ...
Translation of the abstract (German)
Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurde eine Methode zur schnellen und vielseitigen Funktionalisierung von „Liposomenrohlingen“ entwickelt. Weitere Untersuchungen veranschaulichten die Eignung der so erzeugten Sensorvesikel in der Analytik.
Kapitel I liefert eine kurze Einführung in das Konzept der funktionalisierten Vesikel und erläutert dessen Einsatzmöglichkeit im Rahmen von analytischen Anwendungen. In diesem Zusammenhang werden einige etablierte Assayformate beleuchtet, mit welchen sich Rezeptor–Analyt-Bindungen an Vesikelmembranen quantifizieren lassen.
Kapitel II beschäftigt sich mit Wasserstoffbrückenbindungen an Phospholipidmembranen. Diese Art der Wechselwirkung sollte ursprünglich genutzt werden, um Rezeptoren nichtkovalent an Vesikeloberflächen anzubringen. Untersuchungen anhand von Melamin–Barbiturat-Paaren zeigten, dass die vermuteten außergewöhnlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften an der Lipid–Wasser-Grenzfläche nicht ausreichen, um stabile monovalente Komplexe zu ermöglichen. Kooperative Wasserstoffbrückenwechselwirkungen an Vesikelmembranen konnten jedoch unter Ausnutzung von konzentrationsabhängigen Phasentrennungsprozessen in gelartigen Phospholipid-Doppelschichten induziert werden. Die resultierenden dicht gepackten Aggregate der in die Membran eingelagerten amphiphilen Melamine ermöglichten die Interaktion mit komplementären hexavalenten Thymidin-Oligonukleotiden über mehrere Bindungsstellen.
Aufgrund der beobachteten zu geringen Stärke von Wasserstoffbrückenbindungen an der Oberfläche von Liposomen wurde der Forschungsschwerpunkt in Richtung einer kovalenten Modifizierung von Phospholipidmembranen mittels Thiol-basierten Klick-Reaktionen verschoben. Kapitel III und IV zeichnen die Entwicklung dieser Methode nach. Anfängliche Untersuchungen hinsichtlich der Eignung einer radikalischen Thiol–En-Kupplung werden in Kapitel IV zusammengefasst. Diese durch UV-Licht induzierte Reaktion würde die Möglichkeit eröffnen, den Funktionalisierungsprozess zeitlich zu steuern. Es wurde festgestellt, dass radikalische Thiol–En-Additionen im mikromolaren Konzentrationsbereich in wässriger Lösung nicht effizient ablaufen und daher ihre Anwendbarkeit für die nachträgliche Funktionalisierung von Vesikeloberflächen stark eingeschränkt ist. Die nukleophile Variante auf der Basis eines Thiol–Maleinimid-Systems erwies sich im Hinblick auf die geplante Strategie allerdings als geeignet. Darauf aufbauend wurden oberflächenreaktive lumineszente Vesikel durch Selbstanordnung von Phospholipiden, amphiphilen Maleinimiden und Fluoreszenzfarbstoffen in wässriger Lösung hergestellt (Kapitel III). Diese vorgeformten Liposomen wurden mit einer Reihe von Thiol-haltigen Rezeptoreinheiten funktionalisiert, wie zum Beispiel einem Bis-Zn2+-Cyclen Komplex zur Detektion von Phosphaten oder einem DNA-Aptamer, welches das Antibiotikum Ampicillin spezifisch bindet. Die erhaltenen Rezeptor-modifizierten Vesikel zeigten die Bindung der Zielmoleküle an ihre Oberfläche durch eine Änderung der Fluoreszenzeigenschaften von in die Membran eingebetteten Carboxyfluorescein-Farbstoffen an. Das Konzept der nachträglichen Funktionalisierung konnte auch für das molekulare Prägen von Vesikeloberflächen genutzt werden. Die Templat-gesteuerte Strukturierung von Bis-Zn2+-Cyclen-Rezeptoren erzeugte fluoreszente Sensoren, die ein bivalentes Peptid spezifisch detektieren konnten.
In Kapitel V wird die vielseitige Verwendungsmöglichkeit der Post-Funktionalisierungsstrategie durch deren Erweiterung auf ein Thrombin-bindendes Aptamer als Rezeptoreinheit veranschaulicht. Die hergestellten Aptasensoren signalisierten die starke Bindung des Zielmoleküls an die Liposomenoberfläche wiederum durch dynamische Veränderungen der Emissionseigenschaften von fluoreszenten Reporterfarbstoffen, die in die Membran eingelagert wurden. Die Detektion von Thrombin wurde hierbei innerhalb seines physiologischen Konzentrationsbereichs erzielt.
Alles in allem ermöglicht die vorgestellte Methode der nachträglichen Funktionalisierung von Liposomen einen einfachen, schnellen und günstigen Zugang zu verschiedenartigen supramolekularen Sensoren. Wegen des höchst modularen Konstruktionsprinzips kann eine Variation der Rezeptor–Fluorophor-Kombinationen leicht bewerkstelligt werden. Eine Erweiterung dieser Strategie auf Rezeptorelemente basierend auf Peptiden, anderen Oligonukleotiden oder komplexen Makromolekülen ist vorstellbar, wodurch die Entwicklung neuer maßgeschneiderter Sensoren für bioanalytische Anwendungen ermöglicht werden könnte.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 00:16
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