| License: Publishing license for publications excluding print on demand (2MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-316457
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.31645
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 21 April 2015 |
| Referee: | Prof. Dr. Florian Obermeier |
| Date of exam: | 17 April 2015 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Innere Medizin I |
| Keywords: | TLR9, IBD, CED, inflammatory bowel disease, chronisch entzündliche Darmerkrankungen, chronische Colitis |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 31645 |
Abstract (German)
Ein definitiver Auslöser der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) konnte bis dato nicht identifiziert werden. Die lokale Darmflora scheint jedoch eine wesentliche Voraussetzung sowohl für das Zustandekommen von CED als auch für die Ausbildung einer protektiven Immunhomöostase darzustellen. Unmethylierte CpG-Motive - die immunstimulatorische Komponente bakterieller DNA - zeigen dabei ein ...
Abstract (German)
Ein definitiver Auslöser der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) konnte bis dato nicht identifiziert werden. Die lokale Darmflora scheint jedoch eine wesentliche Voraussetzung sowohl für das Zustandekommen von CED als auch für die Ausbildung einer protektiven Immunhomöostase darzustellen. Unmethylierte CpG-Motive - die immunstimulatorische Komponente bakterieller DNA - zeigen dabei ein ähnlich dichotomes Verhalten. Dieses paradoxe Verhalten ist hierbei stark vom zugrunde liegenden Milieu abhängig und insbesondere beim TLR9 - dem Pattern-Recognition Receptor (PRR) für die Erkennung unmethylierter CpG-Motive - bekannt.
Ziel der hier vorliegenden Arbeit war es, die Milieu-abhängige Modifikation der TLR9-Signaltransduktion zu untersuchen. Dazu wurden die TLR9-abhängigen Effekte auf die Genexpression, DNA-Bindungsaffinität und Zellmenge/Zellkernmenge ausgewählter Zytokine, Signalmoleküle und Transkriptionsfaktoren in intestinalen Immunzellen unter gesunden und chronisch entzündlichen Bedingungen verglichen.
Zunächst wurde herausgearbeitet, wie sich der Verlust eines intakten TLR9 im gesunden Organismus auswirkt. Hierfür wurden wildtypische (wt) und TLR9-defiziente (TLR9-/-) Versuchstiere verglichen. Der Verlust eines intakten TLR9 im gesunden Milieu führte dabei einerseits zu deutlich proinflammatorischen Effekten mit erhöhter Zell- und Kernmenge an pNF-κB (p65) sowie erniedrigter DNA-Bindungskapazität des antiinflammatorisch wirkenden pCREB, jedoch andererseits auch zu antiinflammatorischen Effekten mit verstärkter IL-10-Genexpression in den Zellisolaten der Milz und mesenterialen Lymphknoten (MLN).
Anschließend wurden die Effekte bestimmt, die durch eine CpG-Behandlung im gesunden Milieu ausgelöst werden. Gesunde wt Versuchstiere wurden dazu mit CpG-ODN behandelt und anschließend den Kontrolltieren gegenübergestellt. Es konnte gezeigt werden, dass die CpG-vermittelte TLR9-Stimulation im gesunden Milieu gewebeabhängig unterschiedliche Effekte auslöst. Unter CpG-Stimulation kam es dabei in den Isolaten der Lamina Propria Lymphozyten (LPL) auf Ebene der DNA-Bindungsaffinität zu einem Überwiegen der antiinflammatorischen CREB- gegenüber der proinflammatorischen NF-κB-Transaktivierung und einer Erniedrigung der proinflammatorischen IRF7-Transaktivierung. In den MLN-Isolaten zeigten hingegen keine derartigen CpG-Effekte, jedoch war die Zellmenge sowohl an pNF-κB (p65) als auch an pCREB unter CpG-Behandlung verringert. Außerdem führte die gezielte CpG-Behandlung in den MLN-Zellen zu einer verstärkten Expression des proinflammatorischen IRF5-Gens.
Dann wurden gesunde und chronisch entzündete wt Versuchstiere verglichen. Hierzu wurde in den entsprechenden Versuchstieren eine chronische DSS-Colitis induziert. Die pCREB-Transaktivierung zeigte sich dabei im chronisch entzündlichen Milieu sowohl in den MLN- als auch in den LPL-Zellkernextrakten wesentlich stärker ausgeprägt als die NF-κB-Transaktivierung. Dieses Überwiegen der antiinflammatorischen pCREB-Transaktivierung ist dabei möglicherweise durch ein Überwiegen der inaktiven GSK3-β-Form im GSK3-β/pGSK3-β-Gleichgewicht vermittelt. Für das antiviral wirkende IRF7 waren die Milieu-bedingten Effekte gewebeabhängig: Die IRF7-Transaktivierung war in den LPL-Isolaten chronisch DSS-entzündeter Versuchstiere signifikant erniedrigt, wobei sich derartige Effekte in den MLN-Zellkernextrakten nicht zeigten. In den MLN-Zellen chronisch erkrankter Mäuse war im Gegensatz dazu die IRF7-Zellmenge und der IRF7-mRNA-Gehalt signifikant erhöht.
Im Anschluss wurden - analog zu den Untersuchungen im gesunden Milieu - die Effekte einer CpG-Behandlung im entzündlichen Milieu einer chronischen DSS-Colitis herausgearbeitet. In den LPL-Isolaten kam es dabei unter CpG-Behandlung zu einer tendenziellen Verschiebung des Gleichgewichts zwischen CREB- und NF-κB-Transaktivierung in Richtung der proinflammatorischen NF-κB-Transaktivierung. Auch die DNA-Bindungsaffinität des antiviral wirkenden Typ-I-IFN-Induktors IRF7 war in den LPL-Isolaten unter CpG-Stimulation erhöht. In den MLN-Zellkernextrakten wurden derartige Effekte auf DNA-Bindungsebene nicht sichtbar. Die pNF-κB-Zellmenge war in den MLN-Gesamtzelllysaten jedoch unter CpG-Behandlung erhöhte.
Der abschließende Vergleich der CpG-Behandlung chronisch DSS-entzündeter und gesunder Versuchstiere zeigte, dass es in den LPL-Isolaten unter CpG-Behandlung während einer chronischen DSS-Colitis zu einem tendenziellen Überwiegen der proinflammatorischen NF-κB- gegenüber der antiinflammatorischen CREB-Transaktivierung kommt. In den MLN-Zellen zeigte sich darüber hinaus unter CpG-Stimulation im chronisch entzündlichen Milieu die Zellmenge an proinflammatorisch wirkendem IRF7 und pNF-κB deutlich erhöht und das proinflammatorische IL-6-Gen auf mRNA-Ebene signifikant stärker exprimiert. In den MLN-Zellen kam es unter CpG-Behandlung während der chronischen DSS-Colitis jedoch andererseits auch zu einer erhöhten pCREB-Zellmenge.
Translation of the abstract (English)
A definite pathomechanism for inflammatory bowel disease (IBD) could not be identified so far. Published works however have shown that the local intestinal flora is an essential precondition for the development of IBD as well as a protective immune homeostasis. Unmethylated CpG motifs - the immunostimulatory elements of bacterial DNA - show basically similar paradoxical effects like the ...
Translation of the abstract (English)
A definite pathomechanism for inflammatory bowel disease (IBD) could not be identified so far. Published works however have shown that the local intestinal flora is an essential precondition for the development of IBD as well as a protective immune homeostasis. Unmethylated CpG motifs - the immunostimulatory elements of bacterial DNA - show basically similar paradoxical effects like the intestinal flora. This paradoxical effects are strongly dependent on the underlying milieu and are approved for the TLR9, the pattern recognition receptor (PRR) of unmethylated CpG motifs.
The following dissertation should investigate the modification of the TLR9 signalling depending on the underlying milieu. For this purpose, the gene expression, transcription factor activation and intracellular/intranuclear amount of selected cytokines, signalling molecules and transcription factors were detected in intestinal immune cells in healthy and chronic inflammatory conditions.
First of all, the effects of the loss of the intact TLR9 signalling was detected in healthy conditions. For this, wild type (wt) laboratory mice and TLR9 deficient (TLR9-/-) laboratory mice were compared in healthy conditions. The lack of an intact TLR9 signalling in healthy conditions led to proinflammatory effects like an increased intracellular and intranuclear amount of activated NF-κB (p65) and an decreased transcription factor activation of anti-inflammatory pCREB in isolations of splenocytes and mesenteric lymph node (MLN) cells. However, the lack of an intact TLR9 signalling also led to anti-inflammatory effects like an increased expression of the IL-10 gene.
In a second step, the effects of CpG mediated TLR9 stimulation in healthy conditions were investigated. For this purpose, healty wt laboratory mice were treated with CpG motifs and compared to non-treated controls. Hereby, different effects depending on the investigated tissues could be seen. In isolations of lamina propria lymphocytes (LPL) the treatment with CpG motifs led to a predominance of the anti-inflammatory CREB activation compared to the proinflammatory NF-κB activation. The IRF7 activation was also decreased. In isolations of MLN cells no comparable effects were seen. However, the intracellular amount of both NF-κB and CREB was diminished following treatment with CpG motifs in healthy conditions.
Moreover, the expression of the proinflammory IRF5 gene was increased in MLN cells following CpG mediated TLR9 stimulation.
In the next step, healthy wt laboratory mice were compared to wt laboratory mice bearing a chronic DSS induced colitis. It could be shown that in chronic inflammatory conditions the transcription factor activation of pCREB was stronger than that of NF-κB in both LPL and MLN cells. The predominance of the anti-inflammatory CREB activation is possibly induced by the predominance of the inactivated form of GSK3-β in the equilibrium of GSK3-β/pGSK3-β. The effects concerning the antiviral IRF7 were dependent on the investigated tissue: in LPL cells of laboratory mice bearing a chronic DSS induced colitis the transcription factor activation of IRF7 was decreased compared to healty laboratory mice, whereas similar effects could not be shown in MLN cells. In contrast, the intracellular amount of IRF7 and the expression of the IRF7 gene were increased in MLN cells of laboratory mice bearing a chronic DSS induced colitis compared to healty laboratory mice.
In a forth step, the effects of CpG mediated TLR9 stimulation in chronic inflammatory conditions were investigated. For this, wt laboratory mice bearing a chronic DSS induced colitis were treated with CpG motifs and compared to non-treated controls. Treatment with CpG motifs in chronic inflammatory conditions resulted tendentially in the predominance of the proinflammatory NF-κB activation in the equilibrium of CREB/NF-κB in LPL cells. The transcription factor activation of the antiviral IRF7 was also increased after treatment with CpG motifs in LPL cells. In isolations of MLN cells no comparable effects were seen, whereas the intracellular amount of NF-κB was increased after treatment with CpG motifs in MLN cells.
In a final step, the effects of CpG mediated TLR9 stimulation in healthy and chronic inflammatory conditions were directly compared. Hereby, treatment with CpG motifs in chronic inflammatory conditions resulted tendentially in the predominance of the proinflammatory NF-κB activation compared to the anti-inflammatory CREB activation in LPL cells. Furthermore, treatment with CpG motifs in chronic inflammatory conditions led to an increased intracellular amount of the proinflammatory IRF7 and pNF-κB and an increased expression of the proinflammatory IL-6 gene in MLN cells. In contrast, treatment with CpG motifs in chronic inflammatory conditions also resulted in an increase of the intracellular amount of CREB.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 00:04
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