Molecular and functional analyses of the plant specific 3xHMG-box proteins expressed during mitosis/meiosis

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Antosch, Martin

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Date of publication of this fulltext: 27 Apr 2015 12:06

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Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Date:	27 April 2015
Referee:	Prof. Dr. Klaus D. Grasser
Date of exam:	22 April 2015
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Pflanzenwissenschaften > Lehrstuhl für Zellbiologie und Pflanzenphysiologie
Keywords:	3xHMG-box, Mitose, Chromatin
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 570 Life sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	31709

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Abstract (English)

Abstract (English)

The plant specific family of 3xHMG-box proteins contains three HMG-box domains and an N-terminal basic domain that synergistically contribute to its DNA binding and bending properties. So far, they resemble the first group of HMG-box containing proteins which association with chromatin is restricted to mitosis and meiosis.
In this work, a reporter system that allows in vivo studies of 3xHMG-box proteins was successfully developed and tested. Through the usage of the endogenous promoters of 3xHMG-box1 and 3xHMG-box2, expression of the reporter constructs should correspond to the expression of the endogenous genes with respect to transcript level and cell cycle dependency. The reporter system was used to monitor occurance and distribution of 3xHMG-box proteins during G2/M phase in root cells and to test the effect of a putative D-box motif in degradation of 3xHMG-box2.
In contrast to overexpression of 3xHMG-box1-GFP-fusion proteins, overexpression of fusion proteins that consist of 3xHMG-box1 and a GFP with an attached nuclear localization signal leads to strong developmental defects in A. thaliana plants. The 3xHMG-box1-GFP-NLS derived signal was observed to be accumulated as distinct speckles within in the nucleolus, in which rDNA is transcribed and processed. Growth defects in 3xHMG-box1-GFP-NLS overexpression lines could not be connected to decreased transcript levels of 45 rDNA or altered compaction state of 45S rDNA gene regions.
Construction of truncated and chimeric proteins in which the N-terminal domains of 3xHMG-box1 and 3xHMG-box2 were exchanged, suggested a function of the N-terminal domain for the specificity of 3xHMG-box1 for certain rDNA regions. EMSA experiments with 45S rDNA fragments and recombinant N-terminal domains of 3xHMG-box1 and 3xHMG-box2 did not support a sequence specific binding of 3xHMG-box1 N-terminal domain for 45S rDNA.
Association of 3xHMG-box proteins with NORs in allotetraploid A. suecica was tested in subsequent Immunostain and FISH experiments. 3xHMG-box proteins were found to associate with silenced A. thaliana NORs but also with some of the A. arenosa NORs.
Furthermore, plants that simultaneously express 3xHMG-box proteins fused to GFP and linker histones fused to RFP were analyzed. No evidences for antagonistic binding could be obtained.

Translation of the abstract (German)

Die pflanzenspezifischen 3xHMG-box Proteine enthalten 3 HMG-box Domänen und einen N-terminalen basischen Bereich die synergistisch zu den DNA bindenden und beugenden Eigenschaften beitragen. Bisher ist die Proteinfamilie die einzig bekannte Gruppe von HMG-box enthaltenden Proteinen die ausschließlich während der Mitose und Meiose mit Chromatin assoziiert sind.
In dieser Arbeit wurde ein Reporter System etabliert, welches in vivo Studien von 3xHMG-box Proteinen ermöglicht. Durch Benutzung der endogenen Promotoren konnte in Bezug auf Transkriptmenge und Zellzyklusspezifische Expression eine den natürlichen Gegebenheiten entsprechende Situation geschaffen werden. Das Reporter System wurde benutzt um die Verteilung von 3xHMG-box Proteinen in der G2/M Phase in Wurzelzellen zu untersuchen und eines putative D-box Motivs im N-terminalen Bereich von 3xHMG-box1 zu testen.
Im Gegensatz zur Überexpression von 3xHMG1-GFP Fusionsproteinen führt die Expression von 3xHMG-box1-GFP mit einem zusätzlichen Kernlokalisationssignals zu starken Wachstumsdefekten in Arabidopsis thaliana Pflanzen. Das durch 3xHMG-box1-GFP-NLS ausgesendete Signal konnte verstärkt in Form von distinkten Foci innerhalb des Nukleolus beobachtet werden, der Ort an dem die 45S rDNA transkribiert und prozessiert wird.
Die Wachstumsdefekte konnten allerdings nicht auf eine veränderte 45S rDNA Transkriptmenge oder Kompaktierung des Chromatins in diesem Bereich zurückgeführt werden.
In Untersuchung mit verkürzten 3xHMG-box1 Proteinen konnte ein großer Einfluss der N-terminalen Domäne in Bezug auf rDNA Spezifität und Chromatinassoziation festgestellt werden. In EMSA Experimenten konnte allerdings keine sequenzspezifische DNA-Bindung der N-terminalen Domäne von 3xHMG-box1 festgestellt werden
In kombinierten “Immunostaining” und “FISH” Experimenten wurde die Assoziation von 3xHMG-box Proteinen mit NOR’s in allotetraploiden Arabidosis suecia Linien getestet. Dabei konnte festgestellt werden, dass 3xHMG-box1 mit transkriptionell inaktiven Arabidopsis thaliana NOR’s assoziiert ist.
Weiterhin wurde die Verteilung von 3xHMG-box Proteinen und H1 Linkerhistonen verglichen. Eine kompetetive Bindung konnte allerdings nicht festgestellt werden.

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