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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-317460
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.31746
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 27 April 2015 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Rainer Deutzmann |
| Tag der Prüfung: | 9 April 2015 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Orthopädie |
| Stichwörter / Keywords: | microenvironment, cartilage, subchondral bone, mesenchymal stem cells, chondrogenic differentiation |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 31746 |
Zusammenfassung (Englisch)
Objective Osteoarthritis (OA) is characterized by an imbalance in cartilage and subchondral bone homeostasis, which could be potentially treated or improved by cell-based therapies. In the present study, a reproducible in vitro coculture model was established to evaluate the influence of normal and OA- cartilage or subchondral bone explants on chondrogenic differentiation of human bone marrow ...
Zusammenfassung (Englisch)
Objective
Osteoarthritis (OA) is characterized by an imbalance in cartilage and subchondral bone homeostasis, which could be potentially treated or improved by cell-based therapies. In the present study, a reproducible in vitro coculture model was established to evaluate the influence of normal and OA- cartilage or subchondral bone explants on chondrogenic differentiation of human bone marrow derived stem cells (BMSC), human adipose derived stem cells (ASC) and phenotype of OA-chondrocytes. Signals from the articular cartilage or the underlying subchondral bone were hypothesized to induce phenotypic shifts and an altered re- and differentiation potential in cocultured BMSC, ASC and differentiated chondrocytes from OA patients. To provide a chondrogenic environment, cells were embedded in fibrin gel and kept in chondrogenic medium for up to 28 days.
Methods
A reproducible coculture model of ASC, BMSC, mixed cultures (BMSC and chondrocytes in equal ratio) and chondrocytes embedded in fibrin gel seeded on articular cartilage or subchondral bone explants (= co- and tricultures) compared with monocultured cells in fibrin gel without explants was established. Human OA-tissues, OA-chondrocytes and BMSC were derived from patients subjected to arthroplasty. Normal (healthy) human tissues were received from knees of rare trauma affected donors (treated for sports accidents). ASC were isolated from subcutaneous fat tissue obtained from patients undergoing elective body contouring procedures. Ovine cartilage, chondrocytes and BMSC were obtained from normal (healthy) pasture sheep. Gene expression analysis, biochemical assays (ELISA, Dot-blot, DMMB, Hydroxyproline), immunofluorescence staining and biomechanical tests were used to characterize the properties of newly generated extracellular matrix (ECM) from chondrocytes and chondrogenically differentiated ASC and BMSC.
Results
In general, all cell regimens cocultured with OA-explants exhibited reduced gene expression patterns of collagens I, II, III and X in comparison with monocultures. Significant lower levels of collagen I and II protein (BMSC) and significant lower collagen I and III protein (mixed cultures) were detected in cartilage co- or tricultures, while co- and triculture with subchondral bone inhibited collagens in general. In contrast, no changes in glycosaminoglycan (GAG) synthesis were observed for cartilage co- and tricultures, while reduced GAG production was observed in subchondral bone co- and triculture lysates. Repetition of key experiments with normal ASC confirmed inhibitory effects for OA-subchondral bone. Co- and triculture with normal cartilage or subchondral bone explants showed no or only reduced inhibitory effects on chondrogenic differentiation or collagen gene expression. In addition, biomechanical properties of the OA-cartilage or subchondral bone co- and tricultured cell-fibrin gels were affected. All co- and triculture regimens tended to exhibit lower Young´s modulus and aggregate modulus compared with monocultures. In contrast, hydraulic permeability seemed to be higher in co- and tricultures. Supernatants of cartilage and subchondral bone co- and tricultures contained significant higher IL-1β, IL-6 and IL-8 levels, as well as significant more soluble GAGs compared with controls. In general, stimulation of monocultures with IL-1β induced matrix metalloproteinase (MMP)2, and MMP3 and reduced collagens I, II and X gene expression and led to a downregulation of aggrecan gene expression. Stimulation with IL-6 reduced aggrecan, MMP3 and MMP13 gene expression and mainly reduced collagen I, II and III gene expression of BMSC and/or chondrocytes. In contrast, IL-8 stimulation of mixed and chondrocytes monocultures had only little effects, while IL-8 stimulated BMSC showed reduced collagen I, II and III gene expression.
Conclusions
Taken together our results suggest an inhibitory effect of factors from the microenvironment of OA-cartilage and subchondral bone on production of collagens. This indicates a distinct modulatory influence, which affects the composition of the de novo produced ECM from cocultured cells and leads to impaired mechanical strength and biochemical properties of the newly formed matrix. Experiments with ASC, normal cartilage and subchondral bone explants either might hint to disease status induced effects (OA vs. trauma) or to an effect caused by different mean age of cell and tissue donors. Soluble signal factors, i.e. pro-inflammatory cytokines (including IL-1β and IL-6), released from OA-cartilage, OA-subchondral bone, chondrocytes and osteoblasts, might partly mediate these effects on newly formed extracellular matrix properties. Thus, the microenvironment of neighbored OA-cartilage seems to provide both: promoting and inhibiting signals for BMSC differentiation and suggests that the balance of these factors determines the destiny of BMSC. This knowledge can be used to develop new strategies for cell based cartilage regeneration.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Charakteristisch für Osteoarthrose (OA) ist ein Ungleichgewicht der Knorpel- und subchondralen Knochen Homöostase. Die Behandlung und der Verlauf dieser Erkrankung könnte durch zellbasierte Therapien deutlich verbessert werden. In dieser Studie wurde ein reproduzierbares in vitro Kokulturmodell entwickelt, um den Einfluss von OA-Knorpel und -Knochen Explantaten auf die chondrogene Differenzierung ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Charakteristisch für Osteoarthrose (OA) ist ein Ungleichgewicht der Knorpel- und subchondralen Knochen Homöostase. Die Behandlung und der Verlauf dieser Erkrankung könnte durch zellbasierte Therapien deutlich verbessert werden. In dieser Studie wurde ein reproduzierbares in vitro Kokulturmodell entwickelt, um den Einfluss von OA-Knorpel und -Knochen Explantaten auf die chondrogene Differenzierung von adipogenen Stammzellen (ASC), von humanen mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark (BMSC) und den Phänotyp von OA-Chondrozyten zu untersuchen. Vermutlich verursachen Signalfaktoren aus dem artikulären Knorpel und der darunterliegenden subchondralen Knochenschicht einen Shift im Phänotyp oder eine Veränderung im (Re-) Differenzierungspotential von ASC, BMSC und differenzierten Chondrozyten. Um eine chondrogene Mikroumgebung zu schaffen, wurden die Zellen in Fibringel eingebettet und bis zu 28 Tage in chondrogenem Medium kultiviert.
In einem Kokulturmodell wurden in Fibringel eingebettete ASC, BMSC, Chondrozyten oder ein Gemisch aus BMSC und Chondrozyten (zu gleichen Teilen) entweder zusammen mit osteoarthrotischem Knorpel oder subchondralem Knochen kultiviert (= Ko- und Trikultur) und mit den entsprechenden Zellen in Monokultur ohne Explantat verglichen. Alle humanen OA-Gewebestücke wurden aus Patienten entnommen, die einer Arthroplastik unterzogen wurden. Gesundes humanes Gewebe wurde aus Knien von Unfallpatienten gewonnen, die wegen einer Sportverletzung behandelt wurden. ASC wurden aus Unterhautfettgewebe isoliert, das von Patienten einer kosmetischen Fettabsaugung stammt. Genexpressionsanalysen, biochemische Assays (ELISA, Dot-blot, DMMB, Hydroxyprolin), Immunfluoreszenzfärbungen und biomechanische Tests wurden verwendet, um die Eigenschaften der neu gebildeten Matrix von Chondrozyten und chondrogen differenzierten BMSC zu bestimmen.
Im Allgemeinen zeigten alle kokultivierten Zellbedingungen verminderte Genexpression von Kollagen I, II, III und X verglichen mit Monokulturen. Auf Proteinebene konnte signifikant weniger Kollagen I und II (BMSC) und signifikant weniger Kollagen I und III (gemischte Kulturen) in den Knorpel-Ko- und Trikulturen nachgewiesen werden. Die Ko- und Trikultur mit subchondralem Knochen zeigte eine generelle Verminderung der Expression aller Kollagene. Im Gegensatz dazu konnte keine Änderung in der Glykosaminoglykan (GAG) Synthese der Knorpel Ko- und Trikultur nachgewiesen werden, während in der Ko- und Trikultur mit subchondralem Knochen temporär eine Reduktion der GAG Synthese beobachtet werden konnte. Die Wiederholung von Schlüsselexperimenten mit gesunden ASC konnte die inhibitorischen Effekte induziert durch Ko- und Trikultur mit OA-subchondralem Knochen bestätigen. Ko- und Trikultur mit normalem Knorpel oder subchondralem Knochen zeigte keine oder nur verminderte inhibierende Effekte auf die chondrogene Differenzierung oder Gen Expression von Kollagen. Die biomechanischen Eigenschaften der kokultivierten Fibringele waren ebenfalls beeinträchtigt. Alle Ko- und Trikulturbedingungen zeigten tendenziell ein geringeres Elastizitätsmodul und Aggregationsmodul im Vergleich zur Monokultur. Im Gegensatz dazu schien die hydraulische Permeabilität in den Ko-und Trikulturen höher zu sein. Die Überstände von Knorpel- und Knochen Ko- und Trikulturen enthielten im Vergleich mit den Kontrollen signifikant mehr IL-1β, IL-6 und IL-8, und auch mehr lösliche GAGs, die größtenteils von den Explantaten stammten. Die Stimulation der Monokulturen mit IL-1β induzierte im Allgemeinen MMP2, MMP3 und MMP13 und reduzierte die Genexpression der Kollagene I, II und X sowie von Aggrekan. Die Stimulation mit IL-6 verminderte die Aggrekan, MMP3 und MMP13 Genexpression und größtenteils auch der Kollagene I, II und III in BMSC und/oder Chondrozyten. Im Gegensatz dazu hatte die Stimulation mit IL-8 nur geringe Effekte auf gemischte und Chondrozyten Monokulturen, während in den IL-8 stimulierten BMSC eine Reduktion der Kollagene I, II und III beobachtet werden konnte.
Zusammenfassend deuten die Ergebnisse dieser Studie auf einen inhibitorischen Effekt von Faktoren aus der Mikroumgebung von OA-Knorpel oder -subchondralem Knochen auf die Kollagenproduktion hin. Diese Ergebnisse lassen auf einen modulierenden Einfluss schließen, der zu verminderten mechanischen und biochemischen Eigenschaften der neu gebildeten extrazellulären Matrix führt. Die Experimente mit ASC sowie mit normalen Knorpel und subchondralen Knochen Explantaten könnten entweder auf krankheitsbedingte Effekte (OA vs. Trauma) hinweisen oder auf einen Effekt aufgrund des unterschiedlichen Durchschnittsalters der Zell- und Gewebe Spender. Vermutlich regulieren lösliche Signalfaktoren wie z.B. proinflammatorische Zytokine, abgegeben von OA-Knorpel,
OA-subchondralem Knochen, Chondrozyten oder Osteoblasten, zumindest teilweise diese negativen Effekte auf die chondrogene BMSC Differenzierung und die Qualität der neu gebildeten ECM. Dennoch birgt die direkte Mikroumgebung von OA-Knorpel beides: fördernde und inhibierende Signale der BMSC Differenzierung. Dies lässt darauf schließen, dass die Balance dieser Faktoren das Schicksal der BMSC bestimmt. Die in dieser Studie neu gewonnenen Erkenntnisse können in Zukunft dazu beitragen, neue Strategien für die zellbasierte Knorpelregeneration zu entwickeln und vor allem die Qualität des neu gebildeten Knorpels entscheidend zu verbessern.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 00:02
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