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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-318470
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.31847
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 2 Mai 2016 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Bernd Salzberger und Prof. Dr. Ralf Wagner |
| Tag der Prüfung: | 30 April 2015 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Innere Medizin I |
| Stichwörter / Keywords: | HIV-1, AIDS, HLA-B*27, KK10, Escape Mutation, R264K |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 31847 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Eine effektive, HIV-spezifische Immunantwort durch zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) kann ein Grund dafür sein, dass eine HIV-infizierte Person eine verlängerte oder sogar andauernde Kontrolle der HIV-Infektion erlangt 1. Die exprimierten humanen Leukozyten-antigene (HLA) spielen hierbei eine entscheidende Rolle. Vor allem die HLA-B Gene B*27 und B*57 sind wiederholt als protektiv im Fall einer ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Eine effektive, HIV-spezifische Immunantwort durch zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) kann ein Grund dafür sein, dass eine HIV-infizierte Person eine verlängerte oder sogar andauernde Kontrolle der HIV-Infektion erlangt 1. Die exprimierten humanen Leukozyten-antigene (HLA) spielen hierbei eine entscheidende Rolle. Vor allem die HLA-B Gene B*27 und B*57 sind wiederholt als protektiv im Fall einer HIV-Infektion beschrieben worden 2–5. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluss verschiedener Punktmutationen auf die virale Replikationskompetenz. Die untersuchten Mutationen sind zum Teil in vivo und/oder in vitro mit dem CTL-Immunselektionsdruck auf zwei immunodominate p24/Gag-Epitope, TW10 (Aminosäuren 241-250) und KK10 (Aminosäuren 263-272) assoziiert 6,7. Durch Mutagenese wurden provirale Varianten des HIV-Laborstamms NL4-3 generiert und in HEK293T-Zellen transfiziert. Mit den so generierten Viren erfolgte die Infektion einer Reporter-T-Zelllinie. Die Infektiosität der Virusvarianten im Vergleich zum WT wurde anschließend mittels Durchflusszytometrie bestimmt.
Die Mutation R264K im KK10-Epitop von p24 des HIV-1 macht das Virus in vitro nahezu replikationsinkompetent. In Patientenisolaten (in vivo) findet sich die Mutation R264K deshalb fast ausschließlich in der Gegenwart der kompensatorisch wirkenden („sekundären“) Mutation S173A. Die Interaktion von Cyclophilin A (CypA) mit dem viralen Kapsidprotein p24 spielt bei dem beschriebenen Phänotyp eine wichtige Rolle. Wildtyp HIV-1 und die kompensierte Variante sind in vitro CypA-abhängig, wohingegen die R264K-Variante auf eine Inhibierung der CypA/p24 Interaktion, beispielsweise durch Cyclosporin A (CsA), angewiesen ist (CsA-abhängiger Phänotyp).7 Neben R264K sind drei weitere Gag-Mutationen beschrieben, die eine CsA-Abhängigkeit vermitteln: T186A, A224E und G226D 8–10.
In dieser Arbeit wurden vier wichtige Erkenntnisse erzielt: 1) Alle als CsA-abhängig bekannten Varianten wurden in vitro durch die in vivo relevante Mutation S173A kompensiert („universeller Kompensator“). In eingeschränktem Maß gilt dies ebenfalls für die sekundären in vitro Mutationen V218A und A237T. Dies demonstriert, dass es sich bei T186A, A224E, G226D und R264K nicht nur um mehrere zu einem ähnlichen Phänotyp führende Mutationen handelt, sondern dass diese Mutationen den gleichen molekularen Mechanismus beeinträchtigen. 2) Es wurden mehrere, noch nicht beschriebene, kompensatorisch wirksame in vitro Mutationen für die R264K-Variante identifiziert, die in vitro in ihrer Wirkung mit der S173A Mutation vergleichbar sind. 3) Computergestützte Berechnungen einzelner Kapsidvarianten lieferten keine Anhaltspunkte dafür, dass die untersuchten Mutationen die Proteinstruktur von p24 verändern und zeigten zudem, dass die wirksamsten der alternativen kompensatorischen Mutationen in der Region der p24 alpha-Helices 2-5 liegen. 4) Im Gegensatz zu den unter 2) beschriebenen alternativen in vitro Mutationen konnte für in vivo Mutationen eines ausgewählten Patientenisolats kaum ein kompensierender Effekt gezeigt werden. Bei den in vivo Mutationen handelt es sich um HLA-B*57 assoziierte Mutationen, die in einigen der seltenen Isolaten gefunden wurden, in denen R264K in vivo ohne die S173A Mutation nachgewiesen werden konnte.
Die vorliegende Arbeit liefert neue Erkenntnisse über den Einfluss von Punktmutationen auf die Interaktion von p24 mit dem zellulären HIV-1 Ko-Faktor CypA und legt die Vermutung nahe, dass ein weiteres (zelluläres) Protein an p24 bindet und an der Vermittlung des CypA-abhängigen Phänotyps beteiligt ist.
1. Miura, T. et al. HLA-Associated Alterations in Replication Capacity of Chimeric NL4-3 Viruses Carrying gag-protease from Elite Controllers of Human Immunodeficiency Virus Type 1. J. Virol. 83, 140–149 (2009).
2. Migueles, S. A. et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 2709–2714 (2000).
3. Altfeld, M. et al. Influence of HLA-B57 on clinical presentation and viral control during acute HIV-1 infection. AIDS Lond. Engl. 17, 2581–2591 (2003).
4. Streeck, H. et al. Recognition of a Defined Region within p24 Gag by CD8+ T Cells during Primary Human Immunodeficiency Virus Type 1 Infection in Individuals Expressing Protective HLA Class I Alleles. J. Virol. 81, 7725–7731 (2007).
5. Baker, B., Block, B., Rothchild, A. & Walker, B. Elite control of HIV infection: implications for vaccine design. Expert Opin. Biol. Ther. 9, 55–69 (2009).
6. Brockman, M. A. et al. Escape and Compensation from Early HLA-B57-Mediated Cytotoxic T-Lymphocyte Pressure on Human Immunodeficiency Virus Type 1 Gag Alter Capsid Interactions with Cyclophilin A. J Virol 81, 12608–12618 (2007).
7. Schneidewind, A. et al. Escape from the Dominant HLA-B27-Restricted Cytotoxic T-Lymphocyte Response in Gag Is Associated with a Dramatic Reduction in Human Immunodeficiency Virus Type 1 Replication. J Virol 81, 12382–12393 (2007).
8. Braaten, D. et al. Cyclosporine A-resistant human immunodeficiency virus type 1 mutants demonstrate that Gag encodes the functional target of cyclophilin A. J. Virol. 70, 5170–5176 (1996).
9. Yang, R. & Aiken, C. A Mutation in Alpha Helix 3 of CA Renders Human Immunodeficiency Virus Type 1 Cyclosporin A Resistant and Dependent: Rescue by a Second-Site Substitution in a Distal Region of CA. J. Virol. 81, 3749–3756 (2007).
10. Qi, M., Yang, R. & Aiken, C. Cyclophilin A-Dependent Restriction of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Capsid Mutants for Infection of Nondividing Cells. J. Virol. 82, 12001–12008 (2008).
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Some human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) positive individuals display a prolonged or even a sustained control of HIV-1 infection. One possible reason for this is an efficient HIV-1 specific cytotoxic T cell response 1. Human leukocyte antigens (HLA) are essential for CTL-driven immune responses. Two HLA alleles, B*27 and B*57, have repeatedly been shown to be associated with a protective ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Some human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) positive individuals display a prolonged or even a sustained control of HIV-1 infection. One possible reason for this is an efficient HIV-1 specific cytotoxic T cell response 1. Human leukocyte antigens (HLA) are essential for CTL-driven immune responses. Two HLA alleles, B*27 and B*57, have repeatedly been shown to be associated with a protective phenotype in case of HIV-1 infection 2–5. This work describes the impact of specific mutations within the HIV-1 capsid protein p24 on the viral replication capacity. Several of the analyzed mutations are in vitro and / or in vivo associated with CTL-mediated immune selection pressures against two immunodominant p24 epitopes, TW10 (amino acids 241-250) and KK10 (amino acids 263-272) 6,7. Proviral variants of the HIV-1 laboratory-adapted strain NL4-3 were generated by site-directed mutagenesis of an NL4-3 provirus and transfected separately into HEK293T cells. To assess the infectivity of the respective viral variants, a reporter T cell line was infected. Infected cells were identified via flow cytometry. The infectivities of all viral variants are given in relation to wild-type NL4-3.
The escape mutation R264K in the KK10 epitope of the HIV-1 capsid protein p24 mediates a severe replication defect in vitro. Therefore, in patient isolates (in vivo) the R264K mutation is almost exclusively associated with the compensating (“secondary”) mutation S173A. The interaction of cyclophilin A (CypA) with p24 is important for the above described defect. Wild type HIV-1 (i.e. NL4-3) and the compensated variant are CypA-dependent, whereas the variant harboring only the R264K escape mutation is dependent on the inhibition of the CypA/p24 interaction. Since Cyclosporine A (CsA) was used in this work as competitive inhibitor of CypA substrates, the variant R264K is called CsA-dependent in contrast to the CypA-dependent wild type viral variants. Besides R264K the mutations T186A, A224E, and G226D are described to mediate a CsA-dependent replication phenotype 8–10.
Four important insights have been gained in this work: 1) The in vivo relevant mutation S173A compensated for the defects of all the CsA-dependent viral variants (“universal compensator”). To a limited extent, the in vitro secondary mutations V218A and A237T also compensate all four CsA-dependent variants. This strongly suggests that these four mutations not only display a similar phenotype but impair a common molecular mechanism. 2) Several novel in vitro compensating mutations for the R264K-mediated defect are described, which are comparable in their respective efficacies with the in vivo relevant S173A mutation to compensate the replication defect and restore CypA dependency. 3) No evidence was obtained by in silico generated protein structures of the viral variants indicating that the analyzed mutations impaired the structure of the respective p24 monomers. Furthermore, these in silico models highlighted that the most effective of the alternative compensating mutations cluster within a domain of the alpha-helices 2-5. 4) There was no evidence for certain HLA-B*57-associated mutations to efficiently improve the R264K-mediated defect. This is surprising because these mutations were identified in a rare patient-derived viral capsid sequence, which harbored R264K without S173A.
Therefore, this present work provides new insights into the impact of specific capsid mutations on the interaction of p24 with the cellular HIV-1 cofactor CypA and implicates, in accordance with other works, that at least one additional cellular factor is involved in the mediation of the CypA-dependent phenotype.
1. Miura, T. et al. HLA-Associated Alterations in Replication Capacity of Chimeric NL4-3 Viruses Carrying gag-protease from Elite Controllers of Human Immunodeficiency Virus Type 1. J. Virol. 83, 140–149 (2009).
2. Migueles, S. A. et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 2709–2714 (2000).
3. Altfeld, M. et al. Influence of HLA-B57 on clinical presentation and viral control during acute HIV-1 infection. AIDS Lond. Engl. 17, 2581–2591 (2003).
4. Streeck, H. et al. Recognition of a Defined Region within p24 Gag by CD8+ T Cells during Primary Human Immunodeficiency Virus Type 1 Infection in Individuals Expressing Protective HLA Class I Alleles. J. Virol. 81, 7725–7731 (2007).
5. Baker, B., Block, B., Rothchild, A. & Walker, B. Elite control of HIV infection: implications for vaccine design. Expert Opin. Biol. Ther. 9, 55–69 (2009).
6. Brockman, M. A. et al. Escape and Compensation from Early HLA-B57-Mediated Cytotoxic T-Lymphocyte Pressure on Human Immunodeficiency Virus Type 1 Gag Alter Capsid Interactions with Cyclophilin A. J Virol 81, 12608–12618 (2007).
7. Schneidewind, A. et al. Escape from the Dominant HLA-B27-Restricted Cytotoxic T-Lymphocyte Response in Gag Is Associated with a Dramatic Reduction in Human Immunodeficiency Virus Type 1 Replication. J Virol 81, 12382–12393 (2007).
8. Braaten, D. et al. Cyclosporine A-resistant human immunodeficiency virus type 1 mutants demonstrate that Gag encodes the functional target of cyclophilin A. J. Virol. 70, 5170–5176 (1996).
9. Yang, R. & Aiken, C. A Mutation in Alpha Helix 3 of CA Renders Human Immunodeficiency Virus Type 1 Cyclosporin A Resistant and Dependent: Rescue by a Second-Site Substitution in a Distal Region of CA. J. Virol. 81, 3749–3756 (2007).
10. Qi, M., Yang, R. & Aiken, C. Cyclophilin A-Dependent Restriction of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Capsid Mutants for Infection of Nondividing Cells. J. Virol. 82, 12001–12008 (2008).
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 23:58
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