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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-318768
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.31876
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 29 Mai 2015 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Gunter Meister |
| Tag der Prüfung: | 16 März 2015 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie I |
| Stichwörter / Keywords: | miRNA, Argonaute, Volvox |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 31876 |
Zusammenfassung (Englisch)
MicroRNAs (miRNAs) are small, non-coding RNAs of 20-24 nt in length. They are bound by members of the Argonaute protein family and play important roles in various processes including development, cellular homeostasis or response to external stimuli. Mis-regulations of miRNAs cause diseases such as cancers. In several chapters, this thesis describes miRNA profiles, miRNA and Argonaute protein ...
Zusammenfassung (Englisch)
MicroRNAs (miRNAs) are small, non-coding RNAs of 20-24 nt in length. They are bound by members of the Argonaute protein family and play important roles in various processes including development, cellular homeostasis or response to external stimuli. Mis-regulations of miRNAs cause diseases such as cancers. In several chapters, this thesis describes miRNA profiles, miRNA and Argonaute protein characteristics as well as the de novo description of miRNAs and small RNAs in different cellular and organismal systems.
The four human Argonaute (Ago) proteins are highly similar proteins. One distinct difference is the enzymatic activity of Ago2 (Meister et al., 2004), however, detailed studies on the relationship between Ago proteins have been few. This work shows that Ago2 is the most abundant Ago protein in the human cell lines HEK 293T and HeLa (Petri et al., 2011). Ago1 and Ago3 are expressed only to a minor amount, whereas Ago4 expression is hardly detectable. Re-analysis of their enzymatic activity showed that Ago2 remains the only Ago protein capable of cleaving RNA targets (Hauptmann et al., 2013). Following this lead, it could also be demonstrated that not only do Ago1 and Ago3 have difficulties in replacing the passenger strand (the strand of a small RNA duplex that usually gets degraded), but that by increasing the stability of the duplex, on-target effects of an siRNA could be elevated and off-target effects could be alleviated (Petri et al., 2011).
To investigate the potential differences of the four Ago proteins with respect to their miRNA-binding properties, the distribution and the characteristics of miRNAs bound to endogenous Ago proteins were analyzed. By isolating Ago proteins using specific immunoprecipitation, cloning and sequencing of bound miRNAs, it could be shown that Ago proteins bind very similar sets of miRNAs. These miRNAs have in 10 to 20% of the cases non-templated additions of one adenosine. On the individual miRNA level, miRNAs can exist as 5’ or 3’ length variations that are called isomiRs. Investigating isomiRs, it could be shown that Ago2 binds to miRNAs with a broader isomiR spectrum than Ago1 and Ago3 (Dueck et al., 2012). The exceptional role of Ago2 is underscored in the processing of the non-canonical miR-451. Ago2 not only cleaves the precursor of miR-451 (Cheloufi et al., 2010; Cifuentes et al., 2010), but in my thesis it could also be shown that Ago2 exclusively binds miR-451 and does not exchange it with Ago1 or Ago3. Mutational studies on the miR-451 precursor highlight its unique and optimized structure, which renders its use as a backbone for Ago2-specific RNAi tools limited (Dueck et al., 2012).
Following up on the analysis of individual miRNAs and their distribution among Ago proteins, global miRNA profiles under the influence of extracellular stimuli in an immunological setting were examined. Wild-type as well as miR-155-deficient macrophages and dendritic cells (DCs) were stimulated or matured with LPS, LDL, oxidized LDL (oxLDL) or enzymatically lysed LDL (eLDL). MiRNAs were cloned and sequenced and the resulting libraries were compared. Depending on the stimulus, miRNA profiles changed mildly to strongly. The use of miR-155 deficient cells proved to be a powerful tool to establish that miR-155 strongly influences miRNA expression. Examination and comparison the different global miRNA profiles highlighted that miR-155 is a master regulator of downstream miRNA expression.
The green alga Volvox carteri is a model organism for the development of multicellularity. Its proteome and transcriptome is predicted to be highly similar to its closest unicellular relative, Chlamydomonas reinhardtii. Up to date, no protein(s) or mechanism(s) could be identified that explain the big difference in development and morphology between the two organisms. The small RNA repertoire of Volvox carteri and the proteins involved in their biogenesis and exertion of their function was not described when the project was started. Here, we characterized an Argonaute protein of V.carteri, AGO3, and analyzed AGO3-bound small RNAs. A miRNA identification pipeline was constructed and we identified 288 miRNAs contained in 140 miRNA families. Several of the predicted miRNAs were shown to be expressed and modified at their 3’ end, which is typical for plant miRNAs. Additionally, other small RNAs such as repeat-associated small RNAs or phased small RNAs were analyzed. Finally, no overlap of small RNA expression between Volvox and Chlamydomonas could be detected. The existence of a complete new set of small RNAs in Volvox carteri raises the question if the development of multicellularity and the division of labor between somatic and germ cells is at least partially regulated by miRNAs or small RNAs. Future studies, also on other members of the volvocine algae, need to elucidate the role of small RNAs in Volvox carteri further.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
MicroRNAs (miRNAs) sind kleine, nicht-kodierende RNAs mit einer Länge von 20-24 Nukleotiden (nt). Sie werden von einem Mitglied der Argonaute Proteinfamilie gebunden und spielen in verschiedenen Prozessen wie Entwicklung, zelluläre Homöostase oder der Antwort auf externe Stimuli eine große Rolle. Fehl-Regulationen von miRNAs erzeugen Krankheiten wie z.B. Krebs. In dieser Dissertation werden in ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
MicroRNAs (miRNAs) sind kleine, nicht-kodierende RNAs mit einer Länge von 20-24 Nukleotiden (nt). Sie werden von einem Mitglied der Argonaute Proteinfamilie gebunden und spielen in verschiedenen Prozessen wie Entwicklung, zelluläre Homöostase oder der Antwort auf externe Stimuli eine große Rolle. Fehl-Regulationen von miRNAs erzeugen Krankheiten wie z.B. Krebs. In dieser Dissertation werden in Kapiteln unterteilt die Charakteristika von miRNAs und Argonaute Proteinen sowie die Neuerforschung von miRNAs und kleinen RNAs in verschiedenen zellulären Systemen und Organismen beschrieben.
Die vier verschiedenen menschlichen Argonaute (Ago) Proteine sind sich sehr ähnlich. Ein entscheidender Unterschied ist die enzymatische Aktivität von Ago2 (Meister et al., 2004), detaillierte Studien, die das Verhältnis der Ago Proteine untereinander untersuchen, sind jedoch rar. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Ago2 das am stärksten vorhandene Ago Protein in den humanen Zelllinien HEK293T und HeLa ist (Petri et al., 2011). Ago1 und Ago3 wurden in einem deutlich geringerem Maße exprimiert, während Ago4 kaum messbar war. Die wiederholte Analyse ihrer enzymatischen Aktivität zeigte, dass Ago2 das einzige Ago Protein fähig zur Spaltung von Ziel-RNA ist (Hauptmann et al., 2013). Dieser Spur folgend konnte nicht nur gezeigt werden, dass Ago1 und Ago3 Schwierigkeiten haben, sich des Gegenstrangs zu entledigen (der Strang eines kleinen RNA Duplexes, der normalerweise abgebaut wird), sondern auch dass durch die Erhöhung der Duplexstabilität die sogenannten on-target Effekte gesteigert und die off-target Effekte vermindert werden konnten (Petri et al. 2011).
Um eventuelle Unterschiede der vier Ago Proteine bezüglich ihrer miRNA-Bindeeigenschaften zu untersuchen, wurden die Verteilung und Charakteristika von miRNAs, die an die endogenen Proteine gebunden waren, analysiert. Durch die Isolation von Ago Proteinen durch spezifische Immunopräzipitation und das Klonieren und Sequenzieren der gebundenen miRNAs konnte gezeigt werden, dass Ago Proteine sehr ähnliche Mengen und Zusammensetzungen an miRNAs binden. In 10-20% der Fälle haben diese miRNAs sogenannte non-templated additions – also Anhänge, die nicht vom Genom kodiert sind – von einem Adenosin.
Auf dem Level individueller miRNAs können miRNAs mit unterschiedlichen 5’ oder 3’ Längenvariationen existieren. Diese miRNAs werden dann isomiRs genannt. Nach der Untersuchung von isomiRs konnte gezeigt werden, dass Ago2 ein breiteres Längenspektrum an miRNAs bindet als Ago1 und Ago3 (Dueck et al., 2012). Die außergewöhnliche Rolle von Ago2 wird im Prozessieren der nicht-kanonischen miRNA miR-451 unterstrichen. Nicht nur, dass Ago2 den Vorläufer von miR-451 spaltet (Cheloufi et al., 2010; Cifuentes et al., 2010), sondern es konnte in meiner Dissertation auch gezeigt werden, dass miR-451 ausschließlich von Ago2 gebunden wird und nicht an Ago1 oder Ago3 ausgetauscht wird. Mutationsstudien an dem Vorläufer von miR-451 heben seine einzigartige und optimierte Struktur hervor, wodurch seine Anwendung als Werkzeug für Ago2-spezifische RNA Interferenz begrenzt wird (Dueck et al., 2012).
Anschließend an die Analyse von individuellen miRNAs und ihrer Verteilung innerhalb der Ago Proteine wurden globale miRNA Profile unter dem Einfluss von extrazellulären Stimuli in einer immunologischen Umgebung untersucht. Sowohl Wildtyp als auch miR-155-defiziente Makrophagen und dendritische Zellen (DCs) wurden mit LPS, LDL, oxidiertem LDL (oxLDL) oder enzymatisch lysiertem LDL (eLDL) stimuliert bzw. gereift. Die miRNAs wurden kloniert und sequenziert und die resultierenden Datensätze wurden verglichen. Abhängig vom Stimulus änderten sich die miRNA Profile von weniger bis sehr stark. Die Verwendung von miR-155-defizienten Zellen stellte sich als unschätzbares Hilfsmittel heraus, um zu zeigen, dass miR-155 die Expression von miRNAs stark beeinflusst. Die Untersuchung und der Vergleich der verschiedenen globalen miRNA Profile unterstrich, dass miR-155 ein Hauptregulator der nachgelagerten miRNA Expression ist.
Die Grünalge Volvox carteri ist ein Modellorganismus für die Entwicklung zur Vielzelligkeit. Sein Proteom und Transkriptom wurde vorhergesagt, sehr ähnlich zu seinem nächsten Verwandten Chlamydomonas reinhardtii zu sein. Bis dato wurden jedoch keine Proteine oder Mechanismen identifiziert, die den großen Unterschied der beiden Organsimen in Entwicklung und Morphologie erklären könnten. Das Repertoire an kleinen RNAs in Volvox carteri und an Proteinen, die an ihrer Biogenese oder Ausübung ihrer Funktion beteiligt sind, waren zu Beginn dieses Projektes noch nicht beschrieben. In diesem Kapitel wurde ein Argonaute Protein von V.carteri (AGO3) charakterisiert und dessen gebundene kleinen RNAs analysiert. Ein Programm zur Identifizierung von miRNAs wurde entwickelt, mit Hilfe dessen 288 miRNAs in 140 miRNA Familien erkannt werden konnten. Es konnte gezeigt werden, dass einige dieser vorhergesagten miRNAs exprimiert sind und eine Modifikation am 3’ Ende tragen, was typisch für miRNAs aus Pflanzen ist. Zusätzlich wurden andere kleine RNAs wie repeat-assoziierte oder phasierte kleine RNAs analysiert. Schließlich wurde in einer Analyse festgestellt, dass es keinen Überlapp an Expression von kleinen RNAs zwischen Volvox und Chlamydomonas gibt. Die Existenz eines komplett neuen Repertoires an kleinen RNAs in Volvox lässt die Frage aufkommen, ob die Entwicklung der Vielzelligkeit und die Aufteilung in somatische und reproduktive Zellen nicht zumindest teilweise durch miRNAs oder kleine RNAs reguliert wird. Zukünftige Studien, auch an anderen Mitgliedern der volvozinen Algen, werden die Rolle von kleinen RNAs in Volvox carteri weiter erkunden müssen.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 23:57
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