Leopold, Stephanie Anna
(2016)
Mechanismen der neuroprotektiven Wirkung von Norrin.
PhD, Universität Regensburg.
Date of publication of this fulltext: 18 Jul 2016 10:54
Abstract (German)
Norrin ist ein sekretiertes, aus 133 Aminosäuren-bestehendes Signalprotein, welches durch Bindung an den Fzd4-Rezeptor den klassischen Wnt/β-Catenin-Signalweg aktivieren kann. Neben angiogenen Funktionen konnte auch eine neuroprotektive Wirkung von Norrin auf Nervenzellen der Netzhaut nachgewiesen werden. So wiesen zusätzlich mit Norrin behandelte Retinae nach exzitatorischer Schädigung mit NMDA ...
Abstract (German)
Norrin ist ein sekretiertes, aus 133 Aminosäuren-bestehendes Signalprotein, welches durch Bindung an den Fzd4-Rezeptor den klassischen Wnt/β-Catenin-Signalweg aktivieren kann. Neben angiogenen Funktionen konnte auch eine neuroprotektive Wirkung von Norrin auf Nervenzellen der Netzhaut nachgewiesen werden. So wiesen zusätzlich mit Norrin behandelte Retinae nach exzitatorischer Schädigung mit NMDA eine geringere Anzahl apoptotischer Ganglienzellen auf als vergleichbare Kontrollen. In diesem Zusammenhang konnte auch eine erhöhte Expression verschiedener neuroprotektiver Faktoren beobachtet werden, aufgrunddessen ein möglicher Wirkmechanismus von Norrin postuliert wurde. Dabei führt die Norrin-induzierte Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs in Müllerzellen zu einer vermehrten Sekretion von LIF und über einer Steigerung der Edn2-Expression letztlich zu einer Ausschüttung neurotropher Faktoren.
Ziel dieser Arbeit war es, den Mechanismus der Norrin-vermittelten Neuroprotektion anhand von LIF-defizienten Mäusen im akuten Schadensmodell der NMDA-vermittelten exzitatorischen Schädigung retinaler Ganglienzellen genauer zu analysieren. Zusätzlich sollten die Auswirkungen von Norrin auf chronisch degenerierende Ganglienzellen und die damit verbundenen Wirkmechanismen anhand eines Glaukommodells untersucht werden. Hierfür erfolgte die Analyse transgener DBA/2J-Mäuse, welche eine Überexpression von Norrin in den Neuronen der inneren Netzhaut aufweisen.
Durch TUNEL-Analysen konnte gezeigt werden, dass der neuroprotektive Effekt von Norrin in Lif⁺/⁻- und Lif⁻/⁻-Mäusen nach Injektion von NMDA und Norrin vollständig unterdrückt ist. Auch war die Expression von Gfap, Edn2 und Fgf2 in diesen Tieren stark vermindert, was auf eine LIF-abhängige Induktion der Faktoren schließen lässt. Gegenüber der vorangegangen Untersuchungen an Albinomäusen konnte jedoch auch in wildtypischen C57Bl/6-Tieren eine verminderte Expression dieser Faktoren beobachtet werden, wobei die ermittelten Fgf2 mRNA-Spiegel hier über denjenigen von Edn2 lagen. Auch hatte die Expression von Gfap keine detektierbare Gliosereaktion der Müllerzellen zur Folge. Die LIF-vermittelte Expression von Edn2 und Fgf2 scheint somit einen zusätzlichen Mechanismus darzustellen, der in den untersuchten C57Bl/6-Mäusen eine untergeordnete Rolle spielt. Über welchen Signalweg LIF die neuroprotektive Wirkung von Norrin in diesen Tieren weitervermittelt, müssen zukünftige Untersuchungen zeigen.
Durch Analyse der transgenen Pax6-Norrin-Mäuse konnte gezeigt werden, dass Norrin auch auf chronisch degenerierende Ganglienzellen eine protektive Wirkung ausübt. So wiesen Norrin-überexprimierende DBA/2J-Mäuse im Vergleich zu ihren wildtypischen Geschwistertieren weniger schwer ausgeprägte Vorderkammer-Pathologien, einen niedrigeren Augeninnendruck und eine höhere Anzahl von Axonen im Sehnerv auf. Histologische Färbungen zeigten eine verminderte Anzahl immunreaktiver Makrophagen im Trabekelwerk transgener Tiere, was auf einen immunregulatorischen Einfluss von Norrin hindeutet. Zusätzlich konnte in diesen Tieren eine erhöhte Expression von Igf1 und eine verstärkte Phosphorylierungsrate von AKT beobachtet werden. Im Glaukommodell der DBA/2J-Mäuse scheint Norrin seinen protektiven Effekt auf Ganglienzellen demnach über eine Kombination aus vermindertem intraokulären Druck, schwächer ausgeprägter Immunantwort im Trabekelwerk und Aktivierung des protektiv wirksamen PI3K/AKT-Signalwegs zu vermitteln.
Insgesamt konnte durch die Ergebnisse dieser Doktorarbeit gezeigt werden, dass Norrin sowohl auf akut als auch auf chronisch geschädigte retinale Ganglienzellen eine neuroprotektive Wirkung ausübt, wobei unterschiedliche Signalwege genutzt werden.
Translation of the abstract (English)
Norrin is a secreted signaling peptide consiting of 133 aa and able to activate the canonical wnt/β-catenin pathway via binding to fzd4-receptor. Besides angiogenic properties also additional neuroprotective effects on retinal neurons could be proved. After NMDA-induced excitotoxic damage Norrin-treated eyes showed reduced numbers of apoptotic cells compared with control eyes. Based on findings ...
Translation of the abstract (English)
Norrin is a secreted signaling peptide consiting of 133 aa and able to activate the canonical wnt/β-catenin pathway via binding to fzd4-receptor. Besides angiogenic properties also additional neuroprotective effects on retinal neurons could be proved. After NMDA-induced excitotoxic damage Norrin-treated eyes showed reduced numbers of apoptotic cells compared with control eyes. Based on findings that Norrin additionally induces the expression of different neuroprotective factors a hypothetical signaling pathway was created: The Norrin induced activation of wnt/β-catenin pathway in Müller cells leads to an increased expression of Lif and Edn2 which then in turn induces the secretion of neurotrophic factors.
Aim of the thesis was to determine the mechanisms of Norrin-dependend neuroprotection on retinal ganglion cells in an acute model of NMDA-induced excitotoxic damage by using LIF-deficient mice. Furthermore, the effects and mechanisms of Norrin in a glaucoma model of progressive retinal ganglion cell loss should be analyzed. Therefore transgenic DBA/2J mice which overexpress Norrin in the neurons of the inner retina were used for the experiments.
Performing TUNEL assays no reduction of apoptotic cells after injection of NMDA and Norrin in LIF-deficient mice compared to wildtype control mice could be observed. Additionally, expression rates of Gfap, Edn2 and Fgf2 were reduced in these mice suggesting a LIF-depending induction. Interestingly, in contrast to former experiments on albino mice the expression levels in C57Bl/6 wildtype mice were also decreased with higher induction levels for Fgf2 than Edn2. No detectable Müller cell gliosis was observed upon weak Gfap expression. Therefore LIF-dependent induction of Edn2 and Fgf2 expression seems to be part of an additional mechanism, which plays a minor role in the analysed C57Bl/6 mice. The mechanisms by which the neuroprotectiv effect of Norrin is mediated after induction of LIF have to be analysed in further experiments.
Analyzing transgenic Pax6-Norrin (DBA/2J) mice revealed an additional neuroprotective effect of Norrin retinal ganglion cells suffered from chronic degeneration. Norrin-overexpressing DBA/2J showed a weaker anterior angle pathology, lower intraocular pressure and higher numbers of axons in the optic nerve. Immunohistochemical stainings revealed reduced numbers of reactive macrophages in the trabecular meshwork of transgenic mice indicating a modulatory effect of Norrin on immune reactions. Additionally, an increased expression of Igf1 and higher amounts of phosphorylated AKT could be observed in these mice. So, in the glaucoma model of DBA/2J mice, Norrin seems to mediate its neuroprotective effect on retinal ganglion cells via a combination of reduced intraocular pressure, weaker immune reactions in the trabecular meshwork and activation of the neuroprotective PI3K/AKT signaling pathway.
The results of this dissertation show a neuroprotective effect of Norrin on retinal ganglion cells after acute as well as after chronic impairment but mediated via different mechanisms.
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