Niedermair, Tanja
(2016)
Der Einfluss des sensiblen Neurotransmitters SP und des sympathischen Nervensystems auf die enchondrale Ossifikation im Verlauf der Frakturheilung und auf die allgemeine Knochenstruktur in vivo und in vitro.
PhD, Universität Regensburg.
Date of publication of this fulltext: 04 Jul 2016 12:18
Abstract (German)
Nervenfasern des peripheren sensiblen und sympathischen Nervensystems innervieren den Knochen, das Knochenmark und das Periost. Via Neurotransmitter, die von den peripheren Nervenfasern abgegeben werden, moduliert das Nervensystem die enchondrale Ossifikation während des Knochenlängenwachstums und während der Kallusdifferenzierung nach einem Frakturtrauma im adulten Organismus. Die Effekte dieser ...
Abstract (German)
Nervenfasern des peripheren sensiblen und sympathischen Nervensystems innervieren den Knochen, das Knochenmark und das Periost. Via Neurotransmitter, die von den peripheren Nervenfasern abgegeben werden, moduliert das Nervensystem die enchondrale Ossifikation während des Knochenlängenwachstums und während der Kallusdifferenzierung nach einem Frakturtrauma im adulten Organismus. Die Effekte dieser neuronalen Mediatoren auf den Vorgang der enchondralen Ossifikation während der Embryogenese und nach Frakturtrauma im adulten Organismus sind noch weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der sensible Neurotransmitter SP und das sympathische Nervensystem unter physiologischen Knochenumbauprozessen und pathophysiologischen Bedingungen der Kallusreifung nach Fraktur – verwendet als adultes Modell der enchondralen Ossifikation – entscheidende trophische Effekte ausüben.
Durch die Expression des NK1R und die endogene Produktion von SP sind Chondrozyten im Frakturkallus in der Lage autokrin und parakrin zu agieren. Zusätzlich waren TH-immunoreaktive Nervenfasern während des gesamten Heilungsverlaufs im Periost detektierbar. Wir konnten zeigen, dass Zellen im Frakturkallus α1D- und α2B-AR exprimieren und dadurch in der Lage sind auf sympathische Stimuli zu reagieren. 5 Tage nach Fraktur führte das Fehlen von SP zu einer Reduktion der Berührungssensibilität, die Ablation des SNS (Syx) verringerte 8 Tage nach Fraktur die Berührungssensibilität. Die Analysen der Gewebezusammensetzung im Frakturkallus zeigten, dass SyX-Mäuse 5 Tage nach Fraktur einen größeren Anteil an mesenchymalem Kallusgewebe und einen geringeren Anteil an knorpeligem Softkallus aufwiesen, was auf eine Verzögerung des Heilungsprozesses hindeutet. 13 Tage nach Fraktur verzögerte das Fehlen von SP und die SyX die terminale Differenzierung der Chondrozyten, die Fläche mit hypertrophen Chondrozyten im knorpeligen Softkallus von SyX- und Tac1-/- Mäusen war signifikant geringer. Die geringere Anzahl an Osteoblasten und Osteoklasten in den Frakturkalli von Tac1-/- Mäusen lässt vermuten, dass das Fehlen von SP die Differenzierung osteogener Zellen verzögert. Das Fehlen von SNF während der Frakturheilung scheint hingegen die Osteoklastogenese zu aktivieren, worauf die erhöhte Anzahl an Osteoklasten in Frakturkalli sympathektomierter Mäuse hindeutete. Das Fehlen von SP und die Ablation des SNS resultierten 21 Tage nach Fraktur in signifikant verminderten strukturellen Knochenparametern der frakturierten und nicht-frakturierten Femora, wobei die fehlenden sympathischen Effekte eine drastischere Wirkung erzielten. Die biomechanischen Tests bestätigten die beeinträchtigten mechanischen Eigenschaften der frakturierten und nicht-frakturierten Femora von SyX- und Tac1-/- Mäusen. Die in vitro Analysen von isolierten Osteoblasten aus Tac1-/- Mäusen zeigten, dass diese eine geringere ALP-Aktivität aufwiesen, isolierte Osteoklasten zeigten eine höhere Apoptoserate. Isolierte Osteoblasten aus SyX-Mäusen zeigten in vitro eine erhöhte ALP-Aktivität, Osteoklasten aus sympathektomierten Mäusen zeigten eine reduzierte Apoptoserate und einer erhöhte Kathepsin K Aktivität. Das Fehlen von SP und die chemische Sympathektomie beeinflussen die Expression selektiver Gene, die am Matrix-Umbau und an der Entzündungsreaktion beteiligt sind.
Unserer Daten und die aus vorhandener Literatur zeigen, dass das Fehlen von SP die Anzahl und die Resorptionsaktivität von Osteoklasten über den NK1R-vermittelten Signalweg reduziert und so zu einer verringerten Knochenresorptionsrate führt. Gleichzeitig reduziert das Fehlen von SP deutlich die Proliferation und die Aktivität von Osteoblasten, was – trotz verringerter Knochenresorption – zu einer Netto-Reduktion der Knochenbildung führt (Abb. A -1). Die chemische Sympathektomie führt zur selektiven Zerstörung katecholaminerger Nervenfasern, was zu einer geringen NA und Adrenalin Konzentration im Gewebe führt. Da NA in geringen Konzentrationen vornehmlich α-AR stimuliert, vermuten wir, dass NA die α-AR auf den Osteoblasten aktiviert und zu vermehrter Produktion des Osteoklastogenese-fördernden Faktors RANKL führt. Die Aktivierung der α-AR auf Osteoklasten-Vorläuferzellen führt zusätzlich zur vermehrten Produktion von Osteoklastogenese-fördernden Genen. Zudem nehmen sensible Nervenfasern den Wachstumsfaktor NGF auf, was die SP Produktion und die Stimulation der sensiblen Nervenfasern erhöht, woraufhin SP vermehrt in die Peripherie abgegeben werden könnte und die Osteoklastogenese durch Bindung an den NK1R auf den Osteoklasten stimuliert. Diese Mechanismen führen zu einer Induktion der Osteoklastendifferenzierung und -aktivierung und einem Netto-Anstieg der Knochenresorption wohingegen die Rate der Knochenbildung unverändert bleibt.
Translation of the abstract (English)
Nerve fibers of the peripheral sensory and sympathetic nervous system innervate bone, bone marrow and periosteum. Via neurotransmitters – released by peripheral nerve fibers – the nervous system modulates endochondral ossification during bone growth and during callus differentiation after fracture in an adult organism. The effects of these neuronal signals on endochondral ossification during ...
Translation of the abstract (English)
Nerve fibers of the peripheral sensory and sympathetic nervous system innervate bone, bone marrow and periosteum. Via neurotransmitters – released by peripheral nerve fibers – the nervous system modulates endochondral ossification during bone growth and during callus differentiation after fracture in an adult organism. The effects of these neuronal signals on endochondral ossification during embryogenesis and after fracture in an adult organism are largely unknown. This study shows that the sensory neurotransmitter SP and the sympathetic nervous system have crucial trophic effects under physiological bone resorbing processes and pathophysiological situations of callus maturation after fracture – used as an adult model for endochondral ossification.
Chondrocytes in the fracture callus can exert autocrine and paracrine effects as they express the NK1R and produce endogenously SP. We detected TH-immunoreactive nerve fibers in the periosteum throughout the healing process. We demonstrated that cells in the fracture callus express α1D- and α2B-AR and hence could respond to sympathetic stimuli. Touch sensitivity was reduced 5 days after fracture in the absence of SP, ablation of the SNS (SyX) reduced touch sensitivity 8 days after fracture. Analysis of callus tissue composition revealed that SyX-mice developed more mesenchymal callus tissue and less cartilaginous softcallus tissue 5 days after fracture indicating a delay in the healing process. Absence of SP and SNS delayed terminal chondrocyte differentiation 13 days after fracture as the area covered by hypertrophic chondrocytes was significantly reduced in cartilaginous callus of SyX- and Tac1-/- mice. We detected a lower number of osteoclasts and osteoblasts in the fracture calli of Tac1-/- mice indicating that osteogenic differentiation is delayed when SP-signaling is missing. Absence of SNF during fracture healing seems to induce osteoclastogenesis as we found a higher number of osteoclasts in fracture calli of SyX-mice. 21 days after fracture absence of SP and the ablation of the SNS results in significantly impaired structural bone parameters in contralateral and fractured legs, whereby loss of sympathetic nervous system resulted in an even more severe effect. Mechanical testing confirmed the overall reduced bone structural quality in the fractured and contralateral legs of SyX- and Tac1-/- mice. In vitro analysis of primary osteoblasts isolated from Tac1-/- mice showed reduced ALP activity and apoptosis rate was higher in primary osteoclasts isolated from Tac1-/- mice. Primary osteoblasts isolated from SyX-mice revealed a higher ALP activity in vitro, osteoclasts from SyX-mice revealed a reduced apoptosis rate and a higher cathepsin K activity. Absence of SP and SNS modulates expression of selective genes that are involved in matrix remodeling and inflammation. Our data and data from literature confirm that absence of SP signaling reduces number and resorption activity of osteoclasts via NK1R thereby leading to a reduced bone resorption rate. It further reduces proliferation and activity of osteoblasts resulting in a net decrease in bone formation rate despite reduced resorption rate (Fig. A-1). Chemical sympathectomy selectively destroys catecholamiergic nerve fibers resulting in very low concentrations of norepinephrine (NE) and epinephrine (E) in tissues. As low concentrations of NE are acting preferentially via α-AR we propose that NE activates α-AR on osteoblasts increasing production of RANKL, a potent osteoclastogenesis-stimulating factor. Activation of α-AR on osteoclast progenitor cells additionally results in upregulation of osteoclastogenesis-related genes. Moreover, the uptake of NGF by sensory nerve fibers increases SP production and stimulation of sensory nerve fibers and hence could increase SP release from peripheral nerve endings and that way stimulate osteoclastogenesis via binding to the NK1R located on osteoclasts. These mechanisms lead to an induction of osteoclast differentiation and activation and a net increase of bone resorption while bone formation rate remains unaffected.
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