Klement, Johannes Maximilian
(2016)
Die Bedeutung der MAP-Kinasen in der monomer-induzierten Apoptose.
PhD, Universität Regensburg.
Date of publication of this fulltext: 19 Feb 2016 14:00
Abstract (German)
Dentale Kunststoffe treten in direkten Kontakt mit humanen Geweben, insbesondere in tiefen Kavitäten mit dünner bis nicht mehr vorhandener Restdentinschicht mit der Zahnpulpa. Die direkte und indirekte Wirkung der enthaltenen Monomere auf die Pulpazellen sowie deren Antwort darauf ist noch in weiten Teilen unklar. Dass der programmierte Zelltod eine Folge des Kontakts von Monomeren in ...
Abstract (German)
Dentale Kunststoffe treten in direkten Kontakt mit humanen Geweben, insbesondere in tiefen Kavitäten mit dünner bis nicht mehr vorhandener Restdentinschicht mit der Zahnpulpa. Die direkte und indirekte Wirkung der enthaltenen Monomere auf die Pulpazellen sowie deren Antwort darauf ist noch in weiten Teilen unklar. Dass der programmierte Zelltod eine Folge des Kontakts von Monomeren in entsprechend hoher Konzentration auf Zellen ist, wurde gezeigt. Über welchen Signalweg Apoptose aber intrazellulär induziert wird, ist noch nicht ausreichend erforscht. Die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) die die zelleigene Kapazität redox-regulierender Mechanismen übersteigt, ist sehr wahrscheinlich der Grund für Zellschädigung.
Der Ansatz dieser Arbeit war, die Induktion der Apoptose durch HEMA, ein häufiges Monomer zahnärztlicher Komposite, über die Signaltransduktionskaskade der MAP- Kinasen zu prüfen. Es wurde mit RAW264.7 Mausmakrophagen als gut untersuchte Zellen des Immunsystems gearbeitet. Durch pharmakologische Inhibitoren PD98059 (Inhibitor von MEK1/2), SB203580 (Inhibitor von p38) und SP600125 (Inhibitor von JNK1-3) wurden die MAP-Kinasen selektiv inhibiert.
Die mit HEMA inkubierten Zellen wurden nach Färbung der apoptotischen und nekrotischen Zellen mit Annexin und PI mittels FACS Analyse vermessen und die Anteile von Zellen in den verschiedenen Stadien des Zelltods (Apoptose und Nekrose) quantifiziert. Camptothecin, eine bekannt zelltoxische Substanz, diente als Positiv-Kontrolle. LPS, ein bakterielles Endotoxin, diente als Stimulator von MAP- Kinasen sowie NAC als zelluläres Antioxidans. Außerdem wurde durch den Kristallviolett-Test mit den gleichen Ansätzen die Zahl überlebender Zellen (Zytotoxizität) ermittelt.
Es zeigte sich im Kristallviolett-Test ebenso wie in den FACS Analysen, dass steigende Konzentrationen von HEMA die Zahl überlebender Zellen reduzierten. Die Inhibitoren PD98059 und SP600125 hatten im Gegensatz zu SB203580 im Kristallviolett-Test alleine eine stärkere Abnahme der Anzahl überlebender Zellen zur Folge. In der FACS Analyse zeigten alle drei Inhibitoren, dass sie in die Zellen gelangten, jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die mit HEMA assoziierte Apoptose hatten.
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LPS alleine führte in der verwendeten Konzentration sowohl zu einer Reduktion der Zellzahl (Kristallviolett-Test) sowie in der FACS Analyse zur Apoptose (frühe und späte Phase), wobei in Gegenwart von LPS hohe HEMA-Konzentrationen signifikant weniger effektiv waren.
Camptothecin reduzierte die Zellzahl wie erwartet signifikant, wobei auch hier LPS scheinbar diesem Effekt entgegenwirkte. Der Einfluss von LPS auf die Wirkung von Camptothecin war jedoch unabhängig von den Inhibitoren der MAPK ERK1/2, p38 und JNK.
Keiner der inhibierten MAP-Kinase-Signalwege zeigte eine signifikante Änderung des Zellüberlebens oder der Inhibition der Apoptose durch HEMA und sie besitzen wohl keine direkte Bedeutung für die Induktion von Apoptose durch HEMA.
Andererseits scheint der MEK1/2-Signalweg über einen aktuell nicht bekannten Mechanismus Einfluss auf die LPS-induzierte Apoptose zu nehmen. Die Mausmakrophagen wurden ähnlich wie beim JNK-Signalweg vor einer LPS- induzierten Apoptose geschützt.
Auffallend war der schützende Effekt von LPS. Sowohl Zellen, die mit HEMA inkubiert wurden, als auch diese mit Camptothecin, zeigten in Versuchen mit LPS deutlich mehr vitale Zellen. Geringe Konzentrationen von HEMA inhibierten die LPS- induzierte Apoptose. Umgekehrt hemmte die hier verwendete Konzentration von LPS die Induktion von Apoptose durch hohe Konzentrationen (6-8 mM) HEMA. Die konzentrationsabhängige Wechselwirkung zwischen den Effekten von HEMA und LPS erfolgte unabhängig von den Inhibitoren der MAPK und verweist auf zwei getrennte zelluläre Signalwege mit einem Schnittpunkt (crosstalk).
Protektive Wirkung zeigte vor allem NAC, indem es als Antioxidans ein Monomer- oder LPS-induziertes Ungleichgewicht der zellulären Redoxhomöostase ausglich. Es ist von einem komplexen redox-sensitiven System aus proapoptotischen und zellüberlebenden Faktoren auszugehen.
Translation of the abstract (English)
Dental composites and adhesives get directly into contact with human tissues, especially with the dental pulp in deep cavities with thin or no remaining dentin. The direct and indirect impact of resin to the pulp cells and their response is still unclear in many parts. It was shown that programmed cell death (apoptosis) is a consequence of the contact of monomers in a correspondingly high ...
Translation of the abstract (English)
Dental composites and adhesives get directly into contact with human tissues, especially with the dental pulp in deep cavities with thin or no remaining dentin. The direct and indirect impact of resin to the pulp cells and their response is still unclear in many parts. It was shown that programmed cell death (apoptosis) is a consequence of the contact of monomers in a correspondingly high concentration on cells. Which of the signaling pathways inducing apoptosis intracellularly, has not yet been sufficiently investigated. The formation of reactive oxygen species (ROS), which exceeds the cell's capacity of redox-regulating mechanisms, is very likely the reason for cell damage. The approach of this study was to analyze the induction of apoptosis by HEMA, a common monomer of dental composites, through the signal transduction cascade of MAP kinases.
RAW264.7 mouse macrophages were used as well-studied cells of the immune system. Cells were exposed to HEMA (0-8 mM), LPS (0.1 μg/ml) or combinations of both substances for 24h. The influence of mitogen-activated protein kinases (MAPK) on HEMA-induced apoptosis was analyzed using the specific inhibitors PD98059 (ERK1/2), SB203580 (p38) or SP600125 (JNK), and the relevance of oxidative stress was identified by the antioxidant N-acetylcysteine (NAC). Cell survival of RAW264.7 mouse macrophages was determined using a crystal violet assay. After staining of cells with annexin V-FITC and PI (propidium iodide) the percentage of cells in apoptosis or necrosis was analyzed by flow cytometry (FACS). Camptothecin, a known cytotoxic substance, served as a positive control. The bacterial endotoxin LPS served as a stimulator of MAP kinase expression.
The crystal violet assay showed that increasing concentrations of HEMA reduced the number of surviving cells. The inhibitors PD98059 and SP600125 caused unlike SB203580 a decrease of the number of surviving cells. All three inhibitors got in the cells, but had no significant effect on HEMA-associated apoptosis.
LPS alone resulted both in a reduction of cell number (crystal violet assay) as well as in apoptosis after FACS analysis (early and late phase), wherein high HEMA concentrations were significantly less effective in the presence of LPS. Camptothecin reduced the number of cells as expected significantly, which also LPS apparently counteracted this effect. The influence of LPS on the effect of Camptothecin was independent of the inhibitors of the MAPK ERK1/2, p38 and JNK.
None of the inhibited MAP kinase signaling pathways showed a significant change in cell survival or the inhibition of apoptosis by HEMA and they probably do not have
any direct importance for the induction of apoptosis by HEMA. The MEK1/2 pathway seems to take on a currently unknown mechanism affect to the LPS-induced apoptosis. The mouse macrophages were protected similarly to the JNK pathway in response to LPS-induced apoptosis. Striking was the protective effect of LPS. Both, cells incubated with HEMA, and these with Camptothecin, showed significantly more vital cells in experiments with LPS. Low concentrations of HEMA inhibited the LPS- induced apoptosis. Conversely the concentration of LPS used herein inhibited the induction of apoptosis by high concentrations (6-8 mM) of HEMA. The concentration- dependent interaction between the effects of HEMA and LPS was independent of the effects of inhibitors of MAPKs and refers to two separate cellular signaling pathways with an intersection (crosstalk). Protective effects showed especially NAC by offsetting as an antioxidant, a monomer or LPS-induced imbalance of cellular redox homeostasis. It is assumed that there exists a complex redox-sensitive system of pro-apoptotic and cell surviving factors.
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