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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-336369
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 21 April 2016 |
| Referee: | Prof. Dr. Karl Kunzelmann |
| Date of exam: | 7 April 2016 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Physiologie > Prof. Dr. Karl Kunzelmann |
| Keywords: | Volume Regulation, RVD, Anoctamin, Bestrophin, TMC |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 33636 |
Abstract (English)
Volume regulation is a basic cellular property, which is required in every living organism. Cells that are subjected to hypo-osmotic shock will start to swell and subsequently will release K+ and Cl- through K+ and Cl- channels in order to restore their original volume. In 2014, two independent groups identified LRRC8A as a major component of Volume Regulated Anion Channels (VRAC). This thesis ...
Abstract (English)
Volume regulation is a basic cellular property, which is required in every living organism. Cells that are subjected to hypo-osmotic shock will start to swell and subsequently will release K+ and Cl- through K+ and Cl- channels in order to restore their original volume. In 2014, two independent groups identified LRRC8A as a major component of Volume Regulated Anion Channels (VRAC). This thesis provides evidences, that in addition to LRRC8A other chloride channels, namely anoctamins or TMEM16 and bestrophin 1 are involved in volume regulation and offers a putative mechanic model for VRAC activation. Additionally, regarding the high sequence similarity between Anoctamins and TMC (Transmembrane channel like proteins), the role of TMC in volume regulation and Ca2+ signaling is investigated.
Patch clamp analysis of ANO6 (Anoctamin 6 or TMEM16F) overexpressing HEK 293 cells shows a two fold increase in swelling activated whole cell currents compared to control cells. These currents are inhibited by a potent inhibitor of VRAC as well as a number of inhibitors of Anoctamins. VRAC activity and RVD (Regulatory Volume Decrease) are strongly reduced when Ca2+ is removed and the mechanisms are depending on the activation of ANO6. In fact membrane stretch due to cell swelling activates TRP (Transient Receptor Potential) channels, therefore allowing Ca2+ to enter the cells. Simultaneously the intracellular Cl- concentration is diluted due to water influx and releases ANO6 from Cl- inhibition. In addition Ca2+ entering cells during cell swelling may further activate PLA2 (phospholipase A2). This phospholipase cleaves fatty acid from the plasma membrane and the subsequent accumulation of lysophospholipids leads to membrane tension which - together with increased Ca2+ levels - activates ANO6 at the junctional zone.
In addition to ANO6, ANO10 (Anoctamin 10 or TMEM16K) also plays a critical role in volume regulation. This function is identified in Xenopus laevis oocytes and HEK293 cells. It appears that the expression of ANO10 produces large outwardly rectifying whole cell currents when cells are subjected to hypotonic solution. On the other hands, expression of R263H-ANO10, a coding variant of ANO10, fails to produce swelling-activated whole cell currents. ANO10 also augments Ca2+ signaling in HEK293 overexpressing cells, while Ca2+ signaling is reduced when R263H-ANO10 is expressed. These results are in agreement to the localization of ANO10 which we found to be mainly in the endoplasmic reticulum (ER). Therefore we suggest that ANO10 may facilitate volume regulation by changing Ca2+ signaling. Since volume regulation is known to be involved in cell migration, the role of ANO10 on macrophage migration and on their phagocytosis activity is investigated. The study shows that both migration and phagocytotic activity are reduced in the absence of ANO10. These results suggest that ANO10 is a new player in the innate immune system, controlling volume regulation and macrophage function.
Bestrophin 1 is known to be a Ca2+ activated Cl- channel in the retinal pigment epithelial cells (RPE). Its role in volume regulation was also investigated. Interestingly, Best1 knock out mice show impairment related to volume regulation such as sperm morphology and motility. A study conducted in RPE cells isolated from patients with an inherited from of macular dystrophy, carrying heterozygous mutations in Best1, shows absence of swelling-activated whole cell currents, while knockdown of LRRC8A (a putative major component of VRAC) in healthy RPE cells does not affect swelling-activated whole cell currents. Therefore Best1 is suggested to be an essential component of VRAC in human RPE cells and mouse sperm.
Since TMC proteins show sequence similarities to anoctamins, we examined their role in volume regulation. However, none of the TMCs can augment swelling-activated whole cell currents. Surprisingly TMC8 largely reduced swelling-activated whole cell currents in overexpressing HEK293 cells. Not only the swelling-activated currents, but also RVD is largely compromised in the presence of TMC8. Ca2+ measurements reveal that TMC8 inhibits ATP-induced Ca2+ release without affecting Ca2+ level in the ER store or SOCE (Store Operated Calcium Entry). Chelation of intracellular Zn2+ largely inhibited ATP-induced Ca2+ release as well as ATP-activated ANO1 currents. These and further results suggest that upon stimulation with ATP, Zn2+ is co-released with Ca2+ and further augment Ca2+ release from the store. The presence of TMC8 interferes with this process, since it is known that TMC8 interacts with ZnT1-transporter and regulate Zn2+ re-uptake into the ER via ZnT-1.
Translation of the abstract (German)
Volumenregulation ist ein grundlegender Mechanismus, der für alle lebenden Organismen notwendig ist. Zellen schwellen unter einem hypo- osmotischen Schock und aktivieren darauf die Freisetzung von K+ und Cl- Ionen über die Aktivierung von K+- und Cl-- Kanälen, um das Ausgangsvolumen wieder herzustellen. Im Jahre 2014 wurde von zwei unabhängigen Arbeitsgruppen LRRC8A als Hauptkomponente des ...
Translation of the abstract (German)
Volumenregulation ist ein grundlegender Mechanismus, der für alle lebenden Organismen notwendig ist. Zellen schwellen unter einem hypo- osmotischen Schock und aktivieren darauf die Freisetzung von K+ und Cl- Ionen über die Aktivierung von K+- und Cl-- Kanälen, um das Ausgangsvolumen wieder herzustellen. Im Jahre 2014 wurde von zwei unabhängigen Arbeitsgruppen LRRC8A als Hauptkomponente des Volumen- Regulierten Anionen Canals (VRAC) identifiziert. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen aber vermuten, dass auch Anoctamine und Bestrophine an der Volumenregulation beteiligt sind. Darüber hinaus konnte für diese Proteine der Mechanismus ihrer zellvolumen-abhängigen Aktivierung geklärt werden. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit die Rolle der TMC Proteine (TransMembrane Channel-like family of Proteins), die eine hohe Sequenzähnlichkeit zu den Anoctaminen besitzen, für die Volumenregulation und für die Regulation der intrazellulären Ca2+ Konzentration untersucht. Überexpression von ANO6 in HEK293 Zellen induzierte einen zweifachen Anstieg des schwellen- induzierten Ganzzellstroms im Vergleich zur Kontrolle. Dieser induzierte Strom konnte durch Blocker von VRAC und Anoctaminen inhibiert werden. Es konnte ebenfalls zeigt werden, dass die Aktivität von VRAC und die regulatorische Volumen- Verringerung (RVD) stark reduziert waren, wenn Ca2+ aus dem experimentellen System entfernt wurde. Der Mechanismus zur Aktivierung von ANO6 während des Zellschwellens konnte aufklären werden. Durch das Schwellen der Zellen wurden TRP Kanäle aktiviert und es kam zum Einstrom von Ca2+ in die Zelle. Gleichzeitig wurde die intrazelluläre Cl- Konzentration durch den Wassereinstrom verringert und führte zur Enthemmung des Cl- gehemmten ANO6 Kanals. Durch das Schwellen einströmendes Ca2+ aktivierte zusätzlich PLA2 und damit die Freisetzung von Fettsäuren aus der Plasmamembran und dadurch zur Akkumulation von Lyso- Phospholipiden, wodurch sich die Spannung der Plasmamembran änderte. Das Zusammenspiel von Ca2+ und veränderter Membranspannung führte letztlich zur Aktivierung von ANO6 in Mikrodomänen.
Neben ANO6 spielte auch ANO10 eine Rolle für die Volumenregulation. Als erstes wurde die Funktion von ANO10 an der Volumenregulation in Oozyten von Xenopus laevis und HEK293 Zellen untersucht. Waren Zellen hypotoner Lösungen ausgesetzt erzeugte die Expression von ANO10 einen starken auswärts gerichteten Ganzzellstrom. Die Mutation von ANO10 R263H-ANO10 induzierte dagegen keinen Schwellen- induzierten Ganzzellstrom. ANO10 verstärkte den intrazelluläre Ca2+ Signalweg in HEK293 Zellen. Dieser verstärkte Ca2+ Signalweg war in R263H-ANO10 überexprimierten Zellen reduziert. Diese Ergebnisse wurden durch die intrazelluläre Lokalisation von ANO10 im ER unterstützt. ANO10 könnte die Volumenregulation über die Verstärkung des intrazelluläre Ca2+ Signalwegs begünstigen. Da die Regulation des Zellvolumens für die Migration und Phagozytose bei Makrophagen wichtig sein könnte, untersuchten wir den Einfluss von ANO10 auf diese Eigenschaften. Tatsächlich waren die Migrationsrate und die Aktivität der Phagozytose von Makrophagen in der Abwesenheit von ANO10 vermindert. Zusammenfassend zeigten diese Ergebnisse, dass ANO10 die Immunabwehr über eine verbesserte Volumenregulation von Makrophagen unterstützen konnte.
Die vorliegende Arbeit zeigt auch, dass Bestrophin 1 (Best1) an der Volumenregulation beteiligt sein kann. Best1 defiziente Mäuse zeigten eine abnormale Morphologie der Spermien. Zusätzlich war die Motilität der Spermien eingeschränkt, was auf eine fehlende Volumenregulation zurückzuführen war. Untersuchungen an induzierten hiRPE Stammzellen (RPE: Retinales Pigmentepithel) von Patienten mit Makuladegeneration und mutiertem pathologischem Best1 zeigten keinen Schwellen- induziertem Ganzzellstrom. In hiRPE Zellen von gesunden Patienten wurde der Schwellen- induzierte Ganzzellstrom durch das Fehlen von LRRC8A nicht beeinflusst. Daher war zu vermuten, dass Best1 eine wichtige Komponente des VRACs in humanem RPE und in Spermien der Maus ist.
Da TMC Proteine den Anoctaminen sehr ähnlich sind, wurde ihre Rolle für die Volumenregulation untersucht. Dabei wurde gefunden, dass kein Mitglied der TMCs den Schwellen- induzierten Ganzzellstrom verstärken kann. Überraschenderweise reduzierte TMC8 den Schwellen- induzierten Ganzzellstrom in TMC8 exprimierenden HEK293 Zellen. Nicht nur der Ganzzellstrom, sondern auch der RVD war stark beeinträchtigt. Messungen der intrazellulären Ca2+ Konzentration zeigten, dass TMC8 die ATP induzierte Speicherentleerung hemmte, aber weder die Ca2+ Konzentration im ER noch den store operated calcium entry veränderte. Wir konnten zusätzlich zeigen, dass auch Zn2+ die ATP induzierte Speicherentleerung und die Aktivierung von ANO1 hemmt. Wir vermuten, dass Zn2+ für eine verstärkte Freilassung von Ca2+ aus dem ER-Speicher notwendig ist. Es ist bekannt, das TMC8 mit dem Zn2+ Transporter ZnT1 interagiert und somit die Zn2+ Aufnahme ins ER regulieren kann.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 15:37
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