| License: Publishing license for publications including print on demand (2MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-337738
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.33773
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 13 June 2016 |
| Referee: | Prof. Dr. Bernhard Weber |
| Date of exam: | 10 June 2016 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Humangenetik |
| Keywords: | AMD, HTRA1, TGF-β1, microglia |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 33773 |
Abstract (English)
Background. Age-related macular degeneration (AMD) is a multifactorial retinal neurodegenerative disorder and the leading cause of blindness among the elderly worldwide. Genetics is one of several factors which play role in the pathogenesis. An AMD-risk locus on chromosome 10q26 spans two genes namely age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) and high temperature requirement factor A1 ...
Abstract (English)
Background. Age-related macular degeneration (AMD) is a multifactorial retinal neurodegenerative disorder and the leading cause of blindness among the elderly worldwide. Genetics is one of several factors which play role in the pathogenesis. An AMD-risk locus on chromosome 10q26 spans two genes namely age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) and high temperature requirement factor A1 (HTRA1). Controversy exists as to which of the two genes are responsible for increased risk of the disease. HTRA1 is a secreted serine protease reported to play a crucial role in the development of several cancers and neurodegenerative diseases. Biological properties attributed to the putative ARMS2 protein remain elusive.
Aim. The aim of the study was to assess an effect of two AMD-associated synonymous single nucleotide polymorphisms (SNPs) in exon 1 of HTRA1 on the structure and function of the encoded HTRA1 protein. In addition, a putative role of HTRA1 on activation of microglia was investigated.
Methods. Differences in the structures of recombinant non-risk- and risk-associated HTRA1 isoforms were analyzed by MicroScale Thermophoresis (MST) and limited partial proteolysis. The secretion of the different HTRA1 isoforms was analyzed after heterologous expression in Hek293-Ebna cells. By employing MST and in vitro digestion assays, the interaction of HTRA1 isoforms with reported interaction partners, transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and β-casein, was compared. Luciferase assays were applied to compare the regulation of TGF-β1 signaling by different HTRA1 isoforms in MLEC-PAI/Luc cells. The influence of HTRA1 non-risk- and risk-associated isoforms was also analyzed on autocrine TGF-β signaling in BV-2 microglial cells addressing protein and transcript levels of TGF- β target genes. Finally, an effect of HTRA1 on classical (M1) and alternative (M2) activation of microglia was assessed by treating BV-2 cells with known stimulators for both pathways in presence of recombinant HTRA1. The gene expression of markers of M1 and M2 activation as well as nitrite production by M1 microglial cells were investigated.
Results. MST and limited partial proteolysis showed that the conformation of the AMD risk-associated HTRA1 protein is different from that of the non-risk-associated HTRA1 isoforms. The risk-associated isoform was also found to have decreased secretion. While there was no difference of the HTRA1 isoforms in casein binding and digestion, the risk-associated isoform exhibited no binding and decreased digestion of TGF-β1. This eventually affected the regulation of TGF-β signaling in MLEC-PAI/Luc cells and microglial cells. In addition, preliminary data indicate that HTRA1 might be a regulator of M2 microglial activation. Nevertheless, more experiments are required to support the role of HTRA1 on microglial activation.
Conclusion. Our data show an effect of AMD-associated synonymous polymorph-isms on HTRA1 secretion and protein structure, thereby affecting the capacity of HTRA1 to regulate TGF-β signaling. Whether this plays a role in pathogenesis of AMD still remains to be clarified.
Translation of the abstract (German)
Hintergrund. Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine multifaktorielle retinale neurodegenerative Erkrankung und die häufigste Ursache für Erblindung bei älteren Menschen weltweit. Genetik ist einer von mehreren Faktoren, die eine Rolle in der Pathogenese spielen. Ein AMD-Risiko-Locus auf Chromosom 10q26 erstreckt sich über zwei Gene, age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) ...
Translation of the abstract (German)
Hintergrund. Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine multifaktorielle retinale neurodegenerative Erkrankung und die häufigste Ursache für Erblindung bei älteren Menschen weltweit. Genetik ist einer von mehreren Faktoren, die eine Rolle in der Pathogenese spielen. Ein AMD-Risiko-Locus auf Chromosom 10q26 erstreckt sich über zwei Gene, age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) und high temperature requirement Factor A1 (HTRA1). Gegenwärtig ist noch unklar, welches der beiden Gene für ein erhöhtes AMD-Risiko verantwortlich ist. Zahlreiche Studien schreiben HTRA1, einer sekretierten Serinprotease, eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung verschiedener Krebserkrankungen und neurodegenerativer Erkrankungen zu. ie Einem möglichen Genprodukt von ARMS2 werden diverse biologische Eigenschaften zugeschrieben, es herrscht jedoch Unklarheit über tatsächliche Translation und Funktion von ARMS2. .
Ziel. Das Ziel der Studie war, einen Effekt von zwei AMD-assoziiertenEinzelnukleotidpolymorphismen (single nucleotide polymorphisms, SNPs) in Exon 1 von HTRA1 auf die Struktur und Funktion des kodierten HTRA1-Proteins zu ermittlen. Zusätzlich wurde eine mutmaßliche Rolle von HTRA1 bei Aktivierung der Mikroglia adresssiert.
Methods. Strukturelle Unterschiede von rekombinanten, nicht-Risiko- und Risiko-assoziierten HTRA1-Isoformen wurden mittels MicroScaleThermophorese (MST) und partieller Proteolyse analysiert. Die Sekretion der verschiedenen HTRA1-Isoformen wurde nach heterologer Expression in HEK293-EBNA-Zellen analysiert. Mittels MST und in vitro-Proteolyse-Experimenten wurde die Wechselwirkung der HTRA1-Isoformen mit publizierten Interaktionspartnern, TGF-β1 (transforming growth factor-β1) und β-Casein, verglichen. Luciferase-Assays wurden angewendet, um die Regulation des TGF-β1-Signalings durch verschiedene HTRA1 Isoformen in MLEC-PAI/Luc-Zellen zu vergleichen. Der Einfluss von nicht Risiko- und Risiko-assoziierten HTRA1-Isoformen wurde auch auf autokrines TGF-β-Signaling in BV-2 Mikrogliazellen untersucht, indem Zielgene des TGF-β-Signalings auf Protein und Transkriptebene analysiert wurden. Schließlich wurde ein Effekt von HTRA1 auf klassische (M1) und alternative (M2) Aktivierung der Mikroglia untersucht, indem BV-2-Zellen mit bekannten Stimulatoren für beide Wege in Gegenwart von rekombinantem HTRA1 behandelt wurden. Hier wurde die Genexpression von Markern der M1 und M2 Aktivierung, sowie die Nitritproduktion durch M1 Mikroglia-Zellen untersucht.
Ergebnisse. MST und begrenzte Teil Proteolyse zeigten, dass sich die Konformation der AMD-Risiko-assoziierten HTRA1-Isoformvon derjenigen der nicht-Risiko-assoziierten HTRA1 Isoform unterscheidet. Bei der Risiko-assoziierten Isoform wurde auch eine verringerte Sekretion detektiert. Zwar gibt es keinen Unterschied der HTRA1 Isoformen in Bezug auf Casein-Bindung und -Verdau war, jedoch zeigte die Risiko-assoziierte Isoform im Gegensatz zur nicht-Risiko-assoziierten HTRA1 Isoform keine Bindung stabile Bindung von TGF-β1und stark verringerten TGF-ß Verdau. . Dies betraf schließlich die Regulation des TGF-β-Signalings in MLEC-PAI/Luc Zellen und Mikroglia-Zellen. Darüber hinaus zeigen vorläufige Daten dass HTRA1 ein Regulator der M2 Mikroglia-Aktivierung sein könnte. Dennoch sind weitere Experimente erforderlich, um die Rolle von HTRA1 auf Mikrogliaaktivierung zu verifizieren.
Schlussfolgerung. Unsere Daten zeigen einen Effekt von AMD-assoziierten SNPs auf HTRA1 Sekretion und Protein-Struktur, wodurch die Kapazität von HTRA1 zur Regulation des TGF-β-Signalings beeinträchtigt wird. Ob dies eine Rolle bei der Pathogenese von AMD spielt, bleibt noch zu klären.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 22:40
Owner only: item control page
Download Statistics