| License: Publishing license for publications excluding print on demand (6MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-346071
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.34607
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 15 September 2016 |
| Referee: | Prof. Dr. Marina Kreutz |
| Date of exam: | 28 July 2016 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Innere Medizin III (Hämatologie und Internistische Onkologie) |
| Keywords: | tumor immunology; tumor metabolism; lactic acid; lactate; T cells; NK cells; tumor immunosurveillance; immune escape; melanoma; Warburg effect; aerobic glycolysis; Ldha; LDH-5; IFN-γ; immunomodulation |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 34607 |
Abstract (English)
Tumors show alterations in their metabolism to fulfill the requirements of excessive proliferation. The most prominent metabolic change is the switch from OXPHOS to aerobic glycolysis, termed Warburg effect. The increased uptake of glucose, subsequent conversion of pyruvate to lactate and the export of lactate in co-transport with protons lead to the extracellular accumulation of lactic acid and ...
Abstract (English)
Tumors show alterations in their metabolism to fulfill the requirements of excessive proliferation. The most prominent metabolic change is the switch from OXPHOS to aerobic glycolysis, termed Warburg effect. The increased uptake of glucose, subsequent conversion of pyruvate to lactate and the export of lactate in co-transport with protons lead to the extracellular accumulation of lactic acid and occur in the majority of malignant neoplasia. Extracellular lactic acid has been shown to exert a range of direct tumor-promoting effects and there is evidence that various immune cells are impaired by lactic acid. The aim of this dissertation was to clarify the immunomodulatory role of tumor-derived lactic acid.
Ldha expression, coding for the lactate-generating enzyme LDH-5, was downregulated by means of shRNA technology in B16.SIY E12 mouse melanoma cells, resulting in low-lactate producing clones (Ldhalow). Cells transfected with scrambled shRNA were used as a control. Ldhalow clones showed higher OXPHOS than control cells due to increased mitochondrial content. Despite the metabolic differences in Ldhalow clones and control cells, proliferation and cell cycle properties were similar in vitro. In immunocompetent C57BL/6 mice, however, tumor growth of Ldhalow clones was significantly decreased compared to that of control cells. Bioluminescence analyses revealed 50% lower intratumoral lactate concentrations, along with reduced Ldha mRNA expression in Ldhalow tumors compared to control tumors. As other enzymes involved in tumorigenesis and immunosuppression, including IDO, ARG, COX and iNOS, did not show any differences in mRNA expression in Ldhalow tumors and control tumors, reduced tumor growth of Ldhalow clones could be attributed to their diminished lactate production.
Ldhalow tumors contained more leukocytes and among them lower numbers of myeloid cells and B cells, which are said to be pro-tumorigenic, whereas the amount of infiltrating anti-tumoral cytotoxic T cells and NK cells was increased compared to control tumors. Moreover, cytotoxic T cells and NK cells from Ldhalow tumors produced significantly greater amounts of IFN-γ, thereby showing a higher activity than T cells and NK cells from control tumors. Consistently, IFN-γ production of T cells and NK cells was inhibited by lactic acid in vitro. This suggests that tumor immunosurveillance by activated T and NK cells is possible in a low-lactate tumor microenvironment but compromised in the presence of high amounts of lactate.
Accordingly, in the absence of T cells and/or NK cells, tumor growth of Ldhalow clones was accelerated and became similar to that of control cells. Growth control of Ldhalow tumors was also lost in the absence of IFN-γ. This was accompanied by a diminished infiltration of NK cells and activated cytotoxic T cells, indicating a lactate-dependent regulation of IFN-γ production.
In vitro analyses of cytotoxic T cells revealed a lactic-acid induced drop of intracellular pH, and subsequent compromised NFAT expression resulting in a diminished IFN-γ production.
In summary, this dissertation highlights tumor-derived lactic acid as a potent immunomodulatory metabolite which limits effector cell recruitment into the tumor and impairs IFN-γ production of cytotoxic T and NK cells in highly glycolytic tumors. Thereby, tumor immunosurveillance is lost and tumor progression is facilitated.
Interestingly, analyses of cutaneous metastases from melanoma patients displayed high lactate levels along with a reduced infiltration of activated cytotoxic T cells. These findings suggest that lactic acid has immunomodulatory relevance, not only in the mouse model but also for human malignancies.
Translation of the abstract (German)
Tumoren weisen verschiedene Veränderungen in ihrem Stoffwechsel auf. Der Warburg-Effekt, die wohl bedeutendste metabolische Veränderung, ist durch gesteigerte aerobe glykolytische Aktivität charakterisiert. Hierbei wird vermehrt Glukose in die Zelle aufgenommen und zu Laktat umgewandelt. Dieses wird im Co-Transport mit Protonen aus der Zelle ausgeschleust, was zu einer Anreicherung von Laktat und ...
Translation of the abstract (German)
Tumoren weisen verschiedene Veränderungen in ihrem Stoffwechsel auf. Der Warburg-Effekt, die wohl bedeutendste metabolische Veränderung, ist durch gesteigerte aerobe glykolytische Aktivität charakterisiert. Hierbei wird vermehrt Glukose in die Zelle aufgenommen und zu Laktat umgewandelt. Dieses wird im Co-Transport mit Protonen aus der Zelle ausgeschleust, was zu einer Anreicherung von Laktat und Protonen (Milchsäure) im Tumormikromilieu führt. Neben einer Reihe direkter tumorfördernder Effekte gibt es Hinweise auf eine Immunregulation durch Milchsäure. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der immunmodulatorischen Rolle tumorassoziierter Milchsäure.
Dafür wurde die Expression von Ldha, welche für das laktatproduzierende Enzym LDH-5 kodiert, in B16.SIY E12 Mausmelanom-Zellen mittels shRNA-Technologie herunterreguliert. Auf diese Weise generierte Klone (Ldhalow) zeigten eine verminderte Laktatproduktion im Vergleich zu Kontrollzellen, die mit einer “scrambled”-shRNA transfiziert wurden. Ldhalow-Klone wiesen eine erhöhte oxidative Phosphorylierung auf, die der höheren Anzahl an Mitochondrien zuzuschreiben war. Trotz metabolischer Unterschiede der Ldhalow-Klone und der Kontrollzellen differierten diese nicht in Proliferation und Zellzyklus. Jedoch war das Tumorwachstum der Ldhalow-Klone in immunkompetenten C57BL/6-Mäusen deutlich vermindert. Biolumineszenz-Messungen von Ldhalow-Tumoren zeigten eine um 50 % verringerte intratumorale Laktatkonzentration im Vergleich zu Kontrolltumoren. Eine erniedrigte Ldha mRNA-Expression in Ldhalow-Klonen wurde sowohl in vitro als auch in vivo beobachtet. Dies bestätigte die stabile Herrunterregulation der Ldha in den Ldhalow-Klonen. Da sich die mRNA-Expression von anderen in Karzinogenese und Immunsuppression involvierten Enzymen wie IDO, ARG, COX und iNOS, zwischen beiden Gruppen nicht unterschied, wurde das verminderte Tumorwachstum der Ldhalow-Klone der verringerten Laktatproduktion zugeschrieben.
In durchflusszytometrischen Analysen der Ldhalow-Tumoren wurde, im Vergleich zu den Kontrolltumoren, eine erhöhte Infiltration mit Leukozyten gefunden, darunter eine geringere Anzahl an myeloiden Zellen und B-Zellen, welche als protumoral gelten. Antitumorale Immunzellen, wie zytotoxische T-Zellen und NK-Zellen, waren jedoch vermehrt vorhanden. Zudem produzierten zytotoxische T-Zellen und NK-Zellen aus Ldhalow-Tumoren signifikant höhere Mengen an IFN-γ, was ein Zeichen erhöhter Aktivität darstellt. In Übereinstimmung damit ergaben in vitro-Experimente, dass die IFN-γ-Produktion von T- und NK-Zellen durch Milchsäure gehemmt wird. Dies legte nahe, dass eine Tumorimmunkontrolle durch aktivierte T- und NK-Zellen in einer Tumorumgebung mit niedrigen Laktatmengen möglich ist, ein hoher Laktatspiegel dies jedoch verhindert. In Abwesenheit von T- und/oder NK-Zellen wiesen Ldhalow-Tumoren ein vergleichbar schnelles Tumorwachstum auf wie Kontrolltumoren. Die immunologische Wachstumskontrolle von Ldhalow-Tumoren war in Abwesenheit von IFN-γ ebenfalls nicht mehr möglich. Entsprechend waren in diesen Tumoren eine geringere Anzahl infiltrierender NK-Zellen und aktivierter zytotoxischer T-Zellen nachweisbar, was auf eine laktatabhängige Regulation der IFN-γ-Produktion sowie der Rekrutierung von NK-Zellen und aktivierten T-Zellen hindeutet. In vitro-Experimente zeigten, dass Milchsäure eine intrazelluläre Ansäuerung in T-Zellen bewirkt, was die NFAT-Expression beeinträchtigt und so zu verminderter IFN-γ-Produktion führt.
Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die LDHA-assoziierte Anreicherung von Milchsäure im Tumormilieu die Rekrutierung und Aktivierung von zytotoxischen Effektorzellen limitiert. Insbesondere scheint die IFN-γ-Produktion zytotoxischer T-Zellen und NK-Zellen in hochglykolytischen Tumoren beeinträchtigt zu sein. Auf diese Weise kommt es zum Verlust der Tumorimmunkontrolle und zu gesteigertem Tumorwachstum.
Interessanterweise zeigten erste Analysen von Biopsien kutaner Metastasen des humanen Melanoms ebenfalls einen Zusammenhang zwischen hohen Laktatspiegeln und einer geringen Infiltration mit aktivierten zytotoxischen T-Zellen. Diese Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Milchsäure nicht nur im Mausmodel sondern auch in humanen Tumoren immunmodulatorische Effekte hat.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 22:05
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