| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (1MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-349132
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.34913
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 9 Dezember 2016 |
| Begutachter (Erstgutachter): | PD Dr. Sigrid Wittmann |
| Tag der Prüfung: | 23 November 2016 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Anästhesiologie |
| Stichwörter / Keywords: | Phosphodiesterase, PDE, cGMP, Mant-cGMP, Propofol, Thiopental, Diazepam, Proteinextraktion |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 34913 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Der im Organismus ubiquitär verbreitete intrazelluläre Botenstoff cGMP ist die molekulare Grundlage zahlreicher physiologischer und pathologischer Vorgänge. Im Gehirn ist er mit der Mehrzahl der Transmittersysteme vernetzt. Dadurch spielt er unter anderem eine Rolle bei der Regulation von Wachheit und Stressbewältigung. Auf diese Vorgänge nehmen auch Hypnotika und Sedativa, deren Wirkmechanismen ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Der im Organismus ubiquitär verbreitete intrazelluläre Botenstoff cGMP ist die molekulare Grundlage zahlreicher physiologischer und pathologischer Vorgänge. Im Gehirn ist er mit der Mehrzahl der Transmittersysteme vernetzt. Dadurch spielt er unter anderem eine Rolle bei der Regulation von Wachheit und Stressbewältigung. Auf diese Vorgänge nehmen auch Hypnotika und Sedativa, deren Wirkmechanismen bis heute noch nicht vollständig geklärt sind, Einfluss. Im Zuge dieser Arbeit sollte der Einfluss von Propofol, Thiopental und Diazepam auf die neuronale cGMP-spezifische Phosphodiesteraseaktivität untersucht werden, da Phosphodiesterasen (PDEs) für den cGMP-Abbau - dem geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der cGMP-Konzentration- verantwortlich sind.
Für die Versuche in vitro wurden zytosolische Phosphodiesterasen aus Rattenhirn verwendet. Der enzymatische Reaktionsverlauf wurde mit Hilfe des synthetischen, fluoreszierenden Substrats Mant-cGMP, das nach Spaltung sein Fluoreszenzsignal ändert, aufgezeichnet. Die Messung des Mant-cGMP-Signals erfolgte mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) und Fluoreszenzdetektor. Es wurde eine hohe Substratkonzentration gewählt, um eine Sättigung der Bindungsstellen der Phosphodiesterasen zu erreichen. So konnte der Einfluss der Medikamente auf die Enzymreaktion mittels Michaelis-Menten-Kinetik bewertet werden.
Im Vorfeld wurde eine optimierte Methode zur Proteingewinnung mittels maschineller Homogenisierung mit dem FastPrep-24-Instrument entwickelt.
Zudem wurden Vorversuche durchgeführt, die zeigen konnten, dass die gemessene Mant-cGMP-Abnahme einem Abbau durch die PDEs entsprach, keine in vitro-Bildung von cGMP bzw. Mant-cGMP stattfand und eine inhibitorische Wirkung abgebildet werden konnte.
Bei Versuchen mit Propofol (10, 100, 300 μM) wurde keine Wirkung auf die Phosphodiesteraseaktivität gefunden. Aufgrund von Hinweisen aus klinischen Studien, dass Propofol den cGMP-Signalweg beeinflusst, wäre jedoch in Zukunft eine Untersuchung der Beziehung zwischen Propofol und der cGMP-Synthese aufschlussreich. Durch die Zugabe von 500 μM Thiopental konnte eine signifikante Steigerung der Phosphodiesteraseaktivität gemessen werden. Für Thiopental war in der Literatur bereits bekannt, dass es teilweise über eine Hemmung der cGMP-Synthese, also über eine erniedrigte cGMP-Konzentration, wirkt. Die Ergebnisse dieser Arbeit, dass Thiopental in vitro auch über eine Beschleunigung des cGMP-Abbaus zu einer erniedrigten cGMP-Konzentration führt, legen nahe, dass es in vivo so zu einer Wirkpotenzierung kommen könnte. Ein nächster Schritt wäre die Überprüfung und Umsetzung der hier gefundenen Ergebnisse unter in vivo-Bedingungen. Über welchen Mechanismus Thiopental zu einer Erhöhung der Phosphodiesteraseaktivität führt, konnte in dieser Arbeit nicht vollständig geklärt werden und wäre das Ziel anschließender Versuche mit purifizierten PDEs. Für Diazepam lagen bereits aus anderen Studien Daten vor, die zeigen, dass Diazepam die cGMP-Synthese beeinflusst und zusätzlich die cAMP-spezifische Phosphodiesteraseaktivität senkt. Aufgrund der engen Verknüpfung des cAMP- und cGMP-Stoffwechsels wurde im Vorfeld dieser Arbeit vermutet, dass Diazepam auch die cGMP-spezifischen Phosphodiesterasen hemmt. Die Ergebnisse der Versuche mit 100 μM Diazepam validierten dies und zeigten eine verminderte Phosphodiesteraseaktivität von 80 % der unbeeinflussten Aktivität. Die Kinetikanalyse erbrachte den Hinweis, dass es sich dabei um eine reversible kompetitive Hemmung spezifischer PDE-Isoformen handelt. Da in dieser Arbeit ein PDE-Gemisch verwendet wurde, konnte nicht beantwortet werden, welche Isoform von Diazepam gehemmt wird. Für die Entwicklung besserer Medikamente und das Verständnis, wie unerwünschte Nebenwirkungen entstehen, ist dies in Zukunft auch von Interesse. Insbesondere die Kombination von Mant-cGMP und Mant-cAMP würde sich zur Untersuchung des crosstalks an den Phosphodiesterasen eignen
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The intracellular messenger cGMP which is ubiquitously distributed in the organism is the molecular basis of numerous physiological and pathological processes. In the brain it is cross-linked to the majority of the transmitter systems. In this way, it plays a role in the regulation of alertness and stress management. Hypnotics and sedatives, whose mechanisms of action have not yet been completely ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The intracellular messenger cGMP which is ubiquitously distributed in the organism is the molecular basis of numerous physiological and pathological processes. In the brain it is cross-linked to the majority of the transmitter systems. In this way, it plays a role in the regulation of alertness and stress management. Hypnotics and sedatives, whose mechanisms of action have not yet been completely clarified, also influence these processes. Thus this work investigated the influence of propofol, thiopental and diazepam on the neuronal cGMP-specific phosphodiesterase activity as phosphodiesterases (PDEs) are responsible for the degradation of cGMP, which is the determining step of the concentration of cGMP.
In the experiments in vitro cytosolic phosphodiesterases from rat brain were used. The enzymatic reaction was recorded by using the synthetic fluorescent substrate Mant-cGMP, which after being hydrolyzed changes its fluorescence signal. The Mant-cGMP signal was measured by reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) and fluorescence detector. A high substrate concentration was chosen to achieve saturation of the binding sites of the phosphodiesterases.
In this way, the drug’s influence on the enzymatic activity could be characterized using the Michaelis-Menten kinetics.
In the run up to the experiments, an effective and convenient optimized method for protein homogenization and protein extraction has been developed using the FastPrep-24 instrument.
In a next step, preliminary tests proved that the measured Mant-cGMP decrease corresponded to degradation by the PDEs, that no in vitro formation of cGMP or Mant-cGMP took place and that an inhibitory effect could be detected. However, these experiments also showed that the evaluation of the enzyme kinetics according to Michaelis-Menten was limited for competitive inhibitors.
Propofol (10, 100, 300 μM) had no effect on phosphodiesterase activity. However, the results of several clinical trials had shown that propofol affects cGMP signaling. Therefore, further studies of the relationship between propofol and cGMP synthesis would be useful.
The addition of 500 μM thiopental resulted in a significant increase in phosphodiesterase activity. According to former experiences, thiopental was already known to act at least partially via inhibition of the cGMP synthesis, i.e. via a reduced concentration of cGMP. Our results of thiopental reducing in vitro cGMP concentration via an acceleration of the degradation of cGMP suggested a potentiation of the effect of thiopental in vivo. This could be analyzed by experiments using cell models. The mechanism by which thiopental leads to the increase in the phosphodiesterase activity could not be completely clarified in this work and would be the goal of subsequent experiments with purified PDEs. Former studies’ data showed that diazepam influences the cGMP synthesis and furthermore reduces the cAMP-specific phosphodiesterase activity. Due to the close linkage of the cAMP and cGMP metabolism, we assumed in preparation of this work that diazepam also inhibits cGMP-specific phosphodiesterases. The results of the experiments using 100 μM diazepam validated this hypothesis and showed a reduced phosphodiesterase activity of 20%. The kinetic analysis indicated that this was the result of reversible competitive inhibition of specific PDE isoforms. Since in this work a mixture of PDE has been used, it was not possible to determine which isoform was the target of diazepam. For developing optimized drugs and the understanding of mechanisms of adverse effects, further experiments using purified PDEs would be needed. The experimental set-up used could very precisely depict the phosphodiesterase activity, so that a differentiated picture of the substances’ effects was obtained. This experimental setup thus has great potential for the investigation of cGMP metabolism. In particular, the combination of Mant-cGMP and Mant-cAMP would be suitable for studying the crosstalk at the phosphodiesterase’s binding sites.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 15:39
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