| License: Publishing license for publications including print on demand (8MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-363207
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.36320
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 19 November 2018 |
| Referee: | Prof. Dr. Matthias Edinger |
| Date of exam: | 24 October 2017 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Innere Medizin III (Hämatologie und Internistische Onkologie) |
| Keywords: | Regulatorische T-Zellen, Graft-versus-host Erkrankung, aGVHD, Adoptive Treg-Therapie, Hämatopoetische Stammzelltransplantation, In vitro Expansion von Treg, Immunregulation |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 36320 |
Abstract (German)
Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSZT) ist eine kurative Therapieoption für mehrere maligne und einige nicht-maligne Erkrankungen der Hämatopoese, birgt jedoch das Risiko einer schweren Transplantationskomplikation, der Entwicklung einer akuten Graft-versus-host Erkrankung (aGVHD). In murinen Modellen der allogenen HSZT konnte gezeigt werden, dass die Kotransplantation ...
Abstract (German)
Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSZT) ist eine kurative Therapieoption für mehrere maligne und einige nicht-maligne Erkrankungen der Hämatopoese, birgt jedoch das Risiko einer schweren Transplantationskomplikation, der Entwicklung einer akuten Graft-versus-host Erkrankung (aGVHD). In murinen Modellen der allogenen HSZT konnte gezeigt werden, dass die Kotransplantation angereicherter Spender-Treg-Zellen vor letaler aGVHD schützt ohne die GVL-Aktivität von konventionellen Spender-T-Zellen komplett zu inhibieren. Für den Schutz vor aGVHD war eine effiziente Migration der Treg-Zellen in die Lymphknoten erforderlich, wodurch die frühe Expansion alloreaktiver T-Zellen effizient verhindert wurde. Erste klinische Studien bestätigen mittlerweile die Wirksamkeit des Treg-Transfers zur Vermeidung der aGVHD nach haploidenter HSZT. Es war deshalb naheliegend, im nächsten Schritt die therapeutische Wirksamkeit von Spender-Treg in präklinischen Modellen zu überprüfen, was zentrale Fragestellung der vorliegenden Promotionsarbeit war. Da humane wie murine Treg-Zellen nur in geringer Frequenz im peripheren Blut vorliegen, ist für potentielle therapeutische Anwendungen deren in vitro Expansion erforderlich. Um dieses Szenario kliniknah zu simulieren, wurden in vitro Expansionsprotokolle für murine Treg-Zellen etabliert. Dabei konnten frühere Berichte bestätigt werden, wonach lediglich die Population der CD4+CD25+CD62L+ T-Zellen ein adäquates Ausgangsmaterial für die Gewinnung eines reinen Treg-Produktes darstellt, da diese, anders als die CD62L- Subpopulation, zu nahezu 100% den linienspezifischen Transkriptionsfaktor Foxp3 exprimiert und diese Expression nach 14-tägiger in vitro Kultur mit fast 100-facher Expansion stabil aufrechterhielt. Im Unterschied zur CD4+CD25+CD62L- Treg-Subpopulation, die von kontaminierenden Tkonv-Zellen überwachsen wurde, behielt die CD62L+ Startpopulation nicht nur ihren Phänotyp (einschließlich der tTreg-assoziierten Marker Neuropilin und Helios), sondern auch ihre suppressive Aktivität.
Zur Untersuchung der therapeutischen Wirksamkeit solcher Treg-Produkte wurden haplo-idente KMT-Modelle etabliert (hauptsächlich BALB/c in CB6F1, zu Konfirmationszwecken auch C57BL/6 in CB6F1) und in detaillierten Experimenten nachgewiesen, dass bereits an d11 nach KMT sämtliche klinischen, histologischen und zellulären Zeichen einer schweren aGVHD mit Darmbeteiligung vorlagen. In GVHD-Tieren, die an d11 nach KMT in vitro expandierte Spender-Treg-Zellen appliziert bekamen, verbesserte sich die klinische Sympto-matik und damit der Schweregrad der aGVHD und über 65% der Tiere konnten vor der ansonsten letal verlaufenden aGVHD gerettet werden. Die therapeutisch verabreichten Treg (und/oder ihre Nachkommen) waren langfristig in den Tieren nachweisbar und behielten über den dreimonatigen Untersuchungszeitraum homogen ihre Foxp3-Expression, was ihre Linienstabilität bestätigte. Im Rahmen der Analyse der Treg-Wirkmechanismen wurde nachgewiesen, dass die Zellen den Influx und die Proliferation von konventionellen T-Zellen im GI-Trakt inhibieren, die Treg/Tkonv-Ratio anheben, den Einstrom von Granulozyten reduzieren und die Sekretion von inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen supprimieren. In der Summe führten diese Mechanismen zur Regeneration des Darmepithels, was mittels histologischer Untersuchungen bestätigt wurde und eindrücklich an der Rekonstitution von Paneth-Zellen ersichtlich war, die im Rahmen der aGVHD komplett zerstört wurden. Der Nachweis von Lysozym in diesen Zellen sowie die erhöhten Reg3γ-Spiegel belegten die funktionelle Integrität der regenerierten Paneth-Zellen, was sich vermutlich auch positiv auf die GVHD-induzierten Mikrobiomveränderungen auswirkte, die in dieser Arbeit allerdings nicht weiter untersucht wurden. Auch in der Haut ließ sich die therapeutische Wirkung der Spender-Treg nachweisen, da sich die histologischen Veränderungen zurückbildeten und Treg-behandelte Tiere erneutes Fellwachstum in GVHD-induzierten Alopeziearealen zeigten. In Analysen zur lympho-/hämatopoetischen Regeneration nach KMT zeigte sich darüber hinaus, dass die Treg-Therapie die Regeneration der Lymphopoese (am besten ersichtlich anhand der B-Zell-Regeneration) fördert und das GVHD-induzierte KM-Versagen verhindert. Alleine die frühe Schädigung und Fibrosierung von Milz und Lymphknoten konnten durch die einmalige Gabe von Spender-Treg an d11 nicht vollständig verhindert bzw. revidiert werden. Hier konnte durch die wiederholte Gabe von therapeutischen Treg in einem Abstand von 7d jedoch noch eine signifikante Steigerung der Effektivität erreicht werden. Die dadurch erzielte Stärkung des therapeutischen Treg-Pools während der Effektorphase der aGVHD führte zu einer Senkung des maximalen GVHD-Schweregrades und der damit einhergehenden Organschädigung, wodurch die Protektion sowohl der lymphatischen als auch der gastrointestinalen Gewebe erhöht, die nachfolgende Immunrekonstitution und Geweberegeneration verbessert und in der Folge auch die Überlebensrate der Tiere weiter gesteigert werden konnte. Zusammen mit präliminären Ergebnissen einer laufenden klinischen Studie zur Treg-Therapie bei steroidrefraktärer aGVHD (Studienleiter M. Edinger) sprechen die Ergebnisse dieser Arbeit eindeutig für eine Wirksamkeit von Spender-Treg-Zellen in der Therapie der aGVHD. Diese Daten könnten zu einem Umdenken in der GVHD-Therapie beitragen, da sie belegen, dass die bisherige Fokussierung auf unselektive pharmakologische Immunsuppressiva die offensichtlich notwendige Regeneration peripherer Toleranzmechanismen unzureichend berücksichtigt.
Translation of the abstract (English)
Allogeneic stem cell transplantation (SCT) is a curative therapeutic option for several malignant and some non-malignant hematopoietic diseases, but bears the inherent risk of a severe transplantation complication, the development of acute graft-versus-host disease (aGVHD). In murine models of allogeneic SCT it could be shown that the co-transplantation of enriched donor Treg cells protects from ...
Translation of the abstract (English)
Allogeneic stem cell transplantation (SCT) is a curative therapeutic option for several malignant and some non-malignant hematopoietic diseases, but bears the inherent risk of a severe transplantation complication, the development of acute graft-versus-host disease (aGVHD). In murine models of allogeneic SCT it could be shown that the co-transplantation of enriched donor Treg cells protects from lethal aGVHD without completely inhibiting GVL activity of conventional donor T cells. For the prevention of aGVHD, an efficient migration of Treg cells in lymph nodes proved to be necessary, which efficiently prevented early expansion of alloreactive T cells. Meanwhile, first clinical studies confirmed the efficacy of Treg transfer for the prevention of aGVHD after haploidentical SCT. Therefore, the obvious next step was to test the therapeutic efficacy of donor Treg cells in a preclinical model, which was central topic of this PhD-thesis. Because human as well as murine Treg cells make up only a small frequency of cells in peripheral blood, in vitro expansion is essential for potential therapeutic application. To simulate the clinical scenario, in vitro expansion protocols were established for murine Treg cells. Hereby, earlier reports could be confirmed, in which only the CD4+CD25+CD62L+ T cells gave rise to an adequate starting population for a pure Treg product, because nearly 100% of these cells expressed – in contrast to the CD62L- subpopulation – the lineage defining transcription factor Foxp3 and stably retained expression after 14 days in vitro culture with almost 100-fold expansion. In contrast to the CD4+CD25+CD62L- Treg subpopulation, which was overgrown by contaminating Tconv cells, the CD62L+ starting population not only retained its phenotype (including the tTreg associated marker Neuropilin and Helios), but also its suppressive activity.
To investigate the therapeutic efficacy of such Treg products, haploidentical BMT models were established (mainly BALB/c in CB6F1, but also C57BL/6 in CB6F1). In detailed experiments it was proven, that on d11 after BMT all clinical, histological and cellular signs of severe aGVHD with gut involvement were apparent. GVHD animals that received in vitro expanded donor Treg cells at d11 after BMT showed amelioration of clinical symptoms and therefore aGVHD severity and over 65% of the animals could be rescued from otherwise lethal aGVHD. The therapeutic Treg (and/or their progenitors) could be detected and retained a homogenous Foxp3 expression for at least three months, which confirms their lineage stability. In line with the analysis of Treg effector mechanisms it was shown, that the cells inhibit influx and proliferation of conventional T cells in the GI tract, elevate the Treg/Tconv ratio, reduce influx of granulocytes and suppress secretion of inflammatory cytokines and chemokines. All these mechanisms led to the regeneration of the gut epithelium, which was confirmed histologically and could impressively be shown by the reconstitution of Paneth cells, which were completely destroyed in the course of aGVHD. The detection of lysozyme in those cells as well as the elevated Reg3γ levels confirmed the functional integrity of the regenerated Paneth cells, which probably also positively affected the GVHD-induced changes of the microbiome. Therapeutic efficacy of donor Treg could also be shown in the skin, in which the histological changes vanished and Treg-treated animals showed renewed fur growth in GVHD-induced alopecia areas. Furthermore, analyses of the lympho-/hematopoietic regeneration after BMT revealed that Treg therapy promotes regeneration of the lymphopoiesis (best seen by the B cell regeneration) and prevents GVHD-induced BM break-down. Only the early destruction of spleen and lymph nodes could not be prevented entirely or ameliorated by the singular application of donor Treg at d11. Here, subsequent application of therapeutic Treg with a 7d gap achieved a significant increase in efficacy. The hereby gained strengthening of the therapeutic Treg pool during the effector phase of aGVHD led to the reduction of the maximally achieved GVHD severity and the accompanying organ destruction, which improved protection of both the lymphatic as well as gastrointestinal tissues, subsequently also the immune reconstitution and tissue regeneration, which further enhanced the survival rate of the animals. Together with preliminary results of an ongoing clinical study concerning Treg therapy of steroid refractory aGVHD (study director M. Edinger), these results explicitly point to the efficacy of donor Treg cells in the therapy of aGVHD. This data could contribute to a rethinking in GVHD therapy, because they prove that the focus on non-selective pharmacological immunosuppression inadequately considers the obviously crucial regeneration of peripheral tolerance mechanisms.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 20:48
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