Abstract (German)
Erythropoietin (EPO) wird beim Erwachsenen hauptsächlich in den Nieren produziert. Hauptregulator der EPO-Gentranskription ist der Hypoxie-induzierbare Faktor 2 (HIF-2). Unter Normoxie wird die HIF-α-Untereinheit von Prolylhydroxylasen (PHDs) hydroxyliert und vom von Hippel-Lindau (Vhl) Protein erkannt, ubiquitinyliert und so dem proteasomalen Abbau zugeführt. Unter Hypoxie hingegen kann HIF-α ...
Abstract (German)
Erythropoietin (EPO) wird beim Erwachsenen hauptsächlich in den Nieren produziert. Hauptregulator der EPO-Gentranskription ist der Hypoxie-induzierbare Faktor 2 (HIF-2). Unter Normoxie wird die HIF-α-Untereinheit von Prolylhydroxylasen (PHDs) hydroxyliert und vom von Hippel-Lindau (Vhl) Protein erkannt, ubiquitinyliert und so dem proteasomalen Abbau zugeführt. Unter Hypoxie hingegen kann HIF-α nicht hydroxyliert werden, transloziert stattdessen in den Zellkern, dimerisiert dort mit der HIF-1β-Untereinheit und kann dann die Transkription von EPO stimulieren. Die EPO-produzierenden Zellen der Niere sind interstitielle fibroblastenartige Zellen, die sich durch peritubuläre Fortsätze und die Expression der Fibroblastenmarker CD73 und PDGFR-β auszeichnen. Unklar ist die Herkunft dieser Zellen, da einige Befunde für einen Ursprung aus der Neuralleiste sprechen, während andere auf eine Abstammung aus der FoxD1⁺-Stromavorläuferzellpopulation hindeuten.
Da PDGFR-β⁺-Zellen sehr zahlreich in der Niere zu finden sind, jedoch nur ein kleiner Teil davon zur EPO-Synthese beizutragen scheint, war es ein Ziel dieser Arbeit, zu untersuchen, welchen quantitativen Beitrag die PDGFR-β⁺- Zellen der Niere zur EPO-Produktion leisten. Außerdem sollte ein möglicher Ursprung EPO-exprimierender Zellen aus der Neuralleiste untersucht werden. Als Modell dienten PDGFR-β+/iCre Vhl fl/fl- Mäuse, bei denen spezifisch in PDGFR-β⁺-Zellen die HIF-α-Untereinheiten mittels Deletion von Vhl induzierbar stabilisiert werden konnten. Anhand dieses Mausmodells konnte gezeigt werden, dass sehr wahrscheinlich alle renalen PDGFR-β⁺-Zellen fähig sind, HIF-2-abhängig EPO zu produzieren. Dies zeigte sich zum einen darin, dass die Deletion von Vhl in PDGFR-β⁺-Zellen zu einem massiven Anstieg der EPO-mRNA-Abundanz und damit einhergehend zu Polyzythämie und erhöhten Plasma-EPO-Konzentrationen führte. Zum anderen deckte sich die Verteilung der EPO-exprimierenden Zellen beinahe vollständig mit der Verteilung interstitieller PDGFR-β⁺-Zellen. Die gleichzeitige Deletion von Vhl und HIF-2α in PDGFR-β⁺-Zellen resultierte in Anämie und einer erniedrigten renalen EPO-mRNA-Expression. Die Tatsache, dass eine Inhibierung der PHDs in Mäusen mit HIF-2α-defizienten PDGFR-β⁺-Zellen im Gegensatz zu Kontrolltieren keinen stimulierenden Effekt auf die renale EPO-Produktion zeigte, lässt den Schluss zu, dass die PDGFR-β⁺-Zellen die einzigen Zellen in der Niere sind, die EPO exprimieren, zumindest als Reaktion auf den akuten Stimulus der PHD-Inhibierung. Obwohl auch in anderen Organen, wie Herz, Lunge oder Gehirn, zahlreiche PDGFR-β⁺-Zellen vorkommen, kam es nur in den Nebennieren zu einer Induktion der EPO-Gentranskription nach Deletion von Vhl in den PDGFR-β⁺-Zellen, jedoch in deutlich geringerem Ausmaß als in den Nieren. Um zu überprüfen, ob die Fähigkeit der renalen und adrenalen PDGFR-β⁺-Zellen zur EPO-Produktion möglicherweise auf eine Abstammung aus der Neuralleiste zurückzuführen sein könnte, wurde das Verteilungsmuster renaler Zellen mit Ursprung in der Neuralleiste mit der Verteilung EPO-produzierender Zellen der induzierten PDGFR-β+/iCre Vhl fl/fl- Mäuse verglichen. Auf Grund fehlender Übereinstimmung der Expressionsmuster konnten frühere Befunde zur Abstammung EPO-produzierender Zellen der Niere aus der Neuralleiste nicht bestätigt werden. Allerdings konnten Befunde, die auf einen Ursprung in der FoxD1⁺-Stromaprogenitorzellpopulation hindeuten, weiter erhärtet werden. Die Deletion von Vhl in der FoxD1-Zelllinie (FoxD1+/Cre Vhl fl/fl- Mäuse) führte nämlich ebenfalls zu einer Erhöhung der EPO-mRNA-Abundanz sowohl in den Nieren als auch in den Nebennieren. Außerdem zeigte die in situ-Hybridisierung eine deutlich erhöhte Anzahl EPO-produzierender Zellen in den Nieren dieser Tiere verglichen mit Kontrolltieren. Da zudem Tiere mit Vhl- und HIF-2α-Defizienz in der FoxD1-Zelllinie anämisch waren, jedoch kaum renale EPO-mRNA-Expression detektiert werden konnte, legen diese Befunde den Schluss nahe, dass sich alle renalen EPO-exprimierenden Zellen aus der FoxD1⁺-Stromavorläuferzellpopulation ableiten.
Neben interstitiellen Fibroblasten und Perizyten leiten sich auch Renin-produzierende Zellen, Mesangialzellen und vaskuläre Glattmuskelzellen aus der FoxD1-Zelllinie ab. Daher wurde mittels zelltypspezifischer Mausmodelle auch die Auswirkung einer Vhl-Deletion auf diese Zellen untersucht. Dabei konnte sowohl für Renin-, als auch für Mesangialzellen die Induzierbarkeit von EPO in diesen Zellen gezeigt werden. Die Tiere mit vaskulärer glattmuskelzellspezifischer Vhl-Deletion zeigten erhöhte EPO-mRNA-Expressionslevel und damit einhergehend auch erhöhte Plasma-EPO-Konzentrationen. Allerdings konnte mittels in situ-Hybridisierung und immunfluoreszenter Cofärbungen gezeigt werden, dass es sich bei den EPO-positiven Zellen in diesen Nieren nicht um vaskuläre Glattmuskelzellen größerer Blutgefäße, sondern um periendotheliale perizytenartige Zellen handelt.
Diese Befunde zeigen, dass prinzipiell in allen PDGFR-β⁺-Zellen die EPO-Expression induziert werden kann. Dies gilt abgesehen von den vaskulären Glattmuskelzellen auch für alle weiteren renalen Zelltypen, die von der FoxD1-Stromavorläuferzellpopulation abstammen. Die EPO-Induktion erfolgt dabei durch Stabilisierung von HIF-2 mittels Vhl-Deletion.
Translation of the abstract (English)
Erythropoietin (EPO) is mainly produced in the kidneys in adults. Main regulator of the EPO gene transcription is the hypoxia inducible factor 2 (HIF-2). Under normoxic conditions the HIF-α subunit is hydroxylated by prolylhydroxylases (PHDs) and can therefore be recognized and ubiquitinated by the von Hippel-Lindau (Vhl) protein leading to its degradation. Under hypoxic conditions HIF-α ...
Translation of the abstract (English)
Erythropoietin (EPO) is mainly produced in the kidneys in adults. Main regulator of the EPO gene transcription is the hypoxia inducible factor 2 (HIF-2). Under normoxic conditions the HIF-α subunit is hydroxylated by prolylhydroxylases (PHDs) and can therefore be recognized and ubiquitinated by the von Hippel-Lindau (Vhl) protein leading to its degradation. Under hypoxic conditions HIF-α translocates into the nucleus, dimerizes with its HIF-1β subunit and stimulates the transcription of the EPO gene. EPO producing cells are interstitial fibroblast like cells with peritubular processes. They express typical fibroblast cell markers such as CD73 and PDGFR-β. The origin of EPO producing cells is not clear. An origin from neural crest cells or from stromal progenitor cells is discussed.
Since PDGFR-β⁺ cells are widely distributed in the kidney one aim of this study was to analyze to which extent these cells contribute to the renal EPO production. Moreover it should be clarified if the renal EPO expressing cells originate from the neural crest. Mice with an inducible deletion of Vhl in PDGFR-β⁺ cells (PDGFR-β+/iCre Vhl fl/fl mice) were used as a mouse model to stabilize HIF-α. These mice showed a massive increase in the EPO mRNA expression levels. Furthermore, they were polycythemic due to an increase in plasma EPO concentrations. Moreover, the distribution of EPO producing cells was consistent with the distribution pattern of interstitial PDGFR-β⁺ cells. Codeletion of Vhl and HIF-2α in PDGFR-β⁺ cells resulted in anemia and reduced renal EPO mRNA expression levels. Inhibition of PHDs in mice deficient for HIF-2α in PDGFR-β⁺ cells did not stimulate the renal EPO production whereas in control mice there was a strong stimulation. These findings suggest that in principle almost all PDGFR-β⁺ cells are able to produce EPO and that these cells are the only cells to produce EPO in the kidney at least due to the acute stimulus of PHD inhibition. Although PDGFR-β⁺ cells are also widely distributed in other organs like the heart, lung or brain EPO expression could only be induced in some PDGFR-β⁺ cells of the adrenal glands. There was no overlap between the distribution pattern of renal cells which originate from the neural crest and the distribution of renal EPO producing cells in PDGFR-β+/iCre Vhl fl/fl mice. Therefore, earlier findings that EPO producing cells of the kidney have their origin in the neural crest could not be confirmed. Instead, mice with Vhl deletion in FoxD1⁺ stromal progenitor cells (FoxD1+/Cre Vhl fl/fl mice) showed increased renal and adrenal EPO mRNA expression levels compared to control mice. In situ hybridization also displayed an increased number of EPO producing cells in the kidneys of FoxD1+/Cre Vhl fl/fl mice. Moreover, mice with a codeletion of Vhl and HIF-2α in FoxD1⁺ cells were anemic and renal EPO mRNA expression levels were almost absent. These findings point to an origin of renal EPO producing cells from FoxD1⁺ stromal progenitors.
Aside from interstitial fibroblasts and pericytes renin producing cells, mesangial cells and vascular smooth muscle cells also develop from FoxD1⁺ stromal progenitors. Cell type specific deletion of Vhl in either renin producing cells or mesangial cells showed that EPO expression is in principal also inducible in these two cell types. Mice with cell type specific Vhl deletion in vascular smooth muscle cells presented with increased EPO mRNA expression levels and increased plasma EPO concentrations. In situ hybridization however showed no EPO expressing vascular smooth muscle cells. Instead, periendothelial pericyte like cells were positive for EPO.
These results confirm that all renal PDGFR-β⁺ cells are able to produce EPO in principle. Furthermore, this also applies to mature cell types that derive from stromal progenitor cells apart from vascular smooth muscle cells. This shift can be induced by artificial stabilization of HIF-2 by Vhl deletion.
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