| License: Creative Commons Attribution 4.0 PDF - Accepted Version (8MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-363757
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.36375
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 19 November 2018 |
| Referee: | Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Date of exam: | 17 November 2017 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Keywords: | Perfusion, NMR, Kernspinresonanzspektroskopie, lebende Zellen, Tumorzellen, Glioblastom-Zellen, HTZ-349, neurale Stammzellen, ReNCX, Metabolismus, mobile Proteine, mobile Lipide, Antisense Oligonukleotid, ALS, HMDSO, HSQC, T₁, T₂, Diffusion |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 530 Physics 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 36375 |
Abstract (German)
In dieser Arbeit wurde ein Perfusions-System an einem hochauflösenden 800 MHz-NMR-Spektrometer etabliert, welches eine metabolische Analyse vitaler Zellen über einen mehrtägigen Zeitraum ermöglicht. Das System zeichnet sich besonders durch Gasdichtheit und Sterilität aus, wodurch Sauerstoffkonzentrationen von bis zu 2 µmol/l und Messdauern von über 72 Stunden erreicht werden können. Über die ...
Abstract (German)
In dieser Arbeit wurde ein Perfusions-System an einem hochauflösenden 800 MHz-NMR-Spektrometer etabliert, welches eine metabolische Analyse vitaler Zellen über einen mehrtägigen Zeitraum ermöglicht. Das System zeichnet sich besonders durch Gasdichtheit und Sterilität aus, wodurch Sauerstoffkonzentrationen von bis zu 2 µmol/l und Messdauern von über 72 Stunden erreicht werden können. Über die Veränderung der chemischen Verschiebung der Histidin-Resonanzen Hᵟ² und Hᵋ¹ wurde eine kontinuierliche Überwachung des pH-Wertes in der Perfusionskammer etabliert. Der pH-Wert des Mediums kann dabei über die CO₂-Begasung geregelt werden. Dies ermöglicht die Aufrechterhaltung eines physiologischen pH-Werts und die metabolische Untersuchung vitaler Zellen unter pH-Stress. Der Sauerstoffgehalt wurde durch optische Sensoren in der Zu- und Ableitung der Perfusionskammer detektiert, wodurch der Sauerstoffverbrauch der Zellen kontinuierlich überwacht werden kann.
Die Konstruktion einer Injektionseinheit ermöglicht die Zugabe von Additiven in die Perfusionskammer bei gleichbleibender Flussrate. Nach einer Injektion kann die Perfusion mit dem Medium nahezu unterbrechungsfrei fortgesetzt werden. Damit ist es möglich Auswirkungen zeitlich begrenzter Behandlungen der Zellen metabolisch zu untersuchen. Eine Möglichkeit zur Probenentnahme im Ablauf der Perfusionskammer gestattet zudem eine zeitaufgelöste metabolische Untersuchung des Mediums.
Die metabolische Analyse der humanen Glioblastom-Zelllinie HTZ-349 zeigte klare Vorteile der Verwendung eines Perfusions-Systems. Durch die Aufrechterhaltung physiologischer Bedingungen konnte die Zellvitalität nach 72 Stunden stark verbessert werden. Der Anteil an vitalen Zellen erhöhte sich von 6 % im Fall ohne Perfusion auf 55 % unter Perfusion. Durch die Verwendung von Wachstumsfaktoren im Perfusionsmedium könnte dieser Anteil noch weiter erhöht werden. Ohne Perfusion wurde der pH-Wert durch eine hohe Laktat-Synthese stark in den sauren Bereich verschoben. Zudem waren die Zellen durch den schnellen Verbrauch des Metaboliten Glukose dazu gezwungen ihren Energiebedarf durch Lipidoxidation zu decken. Dies konnte durch die Analyse der intrazellulären mobilen Lipidresonanzen beobachtet werden. Ein direkter Vergleich der Zellvitalität unter identischen Bedingungen zeigte zudem, dass das Perfusions-System der Kultivierung in Zellkulturflaschen, auf Grund des kontinuierlichen Nachschubs an frischen Medium und optimaler Sauerstoffversorgung bei physiologischem pH-Wert, überlegen ist.
Die Analyse der Glioblastom-Zelllinie HTZ-349 unter einer 22-stündigen hypoxischen Phase zeigte keine starken metabolischen Veränderungen. Dies könnte den Warburg-Effekt bestätigen, welcher besagt, dass Tumorzellen auch unter aeroben Bedingungen hauptsächlich anaerobe Glykolyse betreiben. Der Vergleich der Sauerstoffverbrauchsrate vor und nach der hypoxischen Phase zeigte jedoch eine deutliche Reaktion der Zellen. Sie sank von anfänglichen 28,1 auf 18,1 µmol O₂ / (l * 1·10⁶ Zellen), bei einer Perfusionsrate von 100 µl/min.
Unter niedrigem pH-Wert zeigten sich deutliche metabolische Veränderungen der Glioblastom-Zellen. Sowohl der Glukose- und Glutamin-Verbrauch als auch die Laktat-Synthese waren in der sauren Phase, im Vergleich zur physiologischen Phase, erniedrigt. Die NMR-sichtbaren Proteine und Lipide zeigten ebenfalls eine markante Beeinflussung durch die Veränderung des pH-Wertes. Insgesamt konnte durch die metabolische Analyse und durch den Sauerstoffverbrauch festgestellt werden, dass die Zellen während der Stressphasen in einen Ruhezustand übergingen und in der physiologischen Phase wieder metabolisch aktiv wurden.
Ein weiterer untersuchter Zelltyp waren humane neurale Stammzellen der Zelllinie ReNCX, welche im Kontext der Behandlung der neurodegenerativen Erkrankung Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) nach der Zugabe eines Antisense Oligonukleotids, im Vergleich zum unbehandelten Fall, metabolisch untersucht wurden. Unterschiede zeigten sich hier hauptsächlich in den NMR-sichtbaren mobilen Proteinen und Lipiden. Dabei konnte ein um 30 % höherer Lipidanteil im Fall der behandelten Zellen festgestellt werden.
Außerdem wurde in dieser Arbeit versucht erste Schritte in Richtung der Charakterisierung der NMR-sichtbaren mobilen Proteine zu unternehmen. In einer Versuchsreihe wurde die Menge an ¹⁵N-markierten Aminosäuren sowie die Kulturdauer ermittelt, bei der die Signalausbeute im ¹H-¹⁵N-HSQC-Spektrum am größten war. Es wurde versucht die stärksten Resonanzen über Vergleiche mit Modelpeptiden einzelnen Aminosäuren zuzuordnen.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das entwickelte Perfusions-System ein breites Spektrum von Anwendungsmöglichkeiten für unterschiedliche Zelltypen bietet. Dieses System kann dazu beitragen den Metabolismus von Stamm- und Tumorzellen besser zu verstehen und Biomarker zur Unterscheidung verschiedener Zelltypen oder einen Behandlungserfolg zu generieren.
Translation of the abstract (English)
In this thesis a perfusion system could be established on a high resolution 800 MHz-NMR-spectrometer, which allows metabolic analysis of living cells over a period of many days. Special features of this system are gas tightness and sterility, which enables an oxygen concentration of 2 µmol/l and a measurement period of over 72 hours. A continuous pH control inside the perfusion chamber could be ...
Translation of the abstract (English)
In this thesis a perfusion system could be established on a high resolution 800 MHz-NMR-spectrometer, which allows metabolic analysis of living cells over a period of many days. Special features of this system are gas tightness and sterility, which enables an oxygen concentration of 2 µmol/l and a measurement period of over 72 hours. A continuous pH control inside the perfusion chamber could be established by analyzing the changes of the chemical shift of the histidine resonances Hᵟ² and Hᵋ¹. The pH value of the medium can be adjusted by variation of the CO₂ fumigation. This permits a constant physiological pH value and a metabolic investigation of living cells under pH stress. The oxygen content can be detected by optical sensors in the inlet and outlet of the perfusion chamber and therefore enable a continuous monitoring of the oxygen consumption of the cells.
An additional constructed injection unit allows the injection of additives into the perfusion chamber at a constant flow rate of the medium. After the injection, the perfusion can be continued nearly without interruption of the flow. This permits the metabolic analysis of the effect of a temporal treatment of the cells. A possibility for fraction sampling enables a temporal resolution of the analysis of the medium.
The metabolic analysis of human glioblastoma cell line HTZ-349 shows obvious advantages of using a perfusion-system. The maintenance of physiological conditions strongly improves the cell vitality after 72 hours. The percentage of living cells increases from 6 % in the case without perfusion to 55 % under perfusion. The use of growth factors in the perfusion medium could further improve this percentage. Without perfusion the pH value was shifted into the acidic region, due to a strong lactic acid synthesis. Moreover, the cells were forced to cover their energy demand through lipid oxidation, because of the fast glucose deprivation. This could be investigated by analyzing the intracellular mobile lipid resonances. Comparison of the cell vitality under identical conditions showed, that the perfusion system is superior to cultivation in cell culture flasks, because of the continuous delivery of fresh medium and an optimum oxygen supply at physiological pH value.
The analysis of glioblastoma cell line HTZ-349 under hypoxia over 22 hours showed no strong metabolic changes. This could confirm the Warburg effect, which says, that tumor cells prefer the anaerobic glycolysis also under aerobic conditions. But there was a clear cellular reaction in the comparison of the oxygen consumption rate before and after hypoxia. This consumption rate decreased from 28.1 to 18.1 µmol O₂ / (l * 1·10⁶ cells) at a perfusion rate of 100 µl/min.
Under low pH conditions there were obvious metabolic changes of the glioblastoma cells. Glucose and glutamine consumption as well as lactic acid synthesis were lower in the acidic phases in comparison to physiological conditions. The NMR-visible proteins and lipids showed also a strong influence of the pH change. Altogether metabolic analysis and oxygen consumption suggest, that the cells were in a quiescent state during the pH stress and showed a metabolic activity during the physiological phase.
A further investigated cell type were the human neural stem cells of the cell line ReNCX, which were used in the context of the treatment of the neurodegenerative disorder amyotrophic lateral sclerosis (ALS) after adding an antisense oligonucleotide, to investigate the metabolic influences in comparison to the untreated case. Differences were mainly observable in the NMR-visible mobile proteins and lipids. Metabolic analysis showed a 30 % higher lipid content in the case of the treated cells.
Furthermore, during this thesis first steps in direction of characterization of the NMR-visible mobile proteins were taken. In a series of experiments the quantity of ¹⁵N labelled amino acids as well as the optimum culture period was determined, which gave rise to the strongest signals in the ¹H-¹⁵N-HSQC spectrum. Subsequent first attempts were made to assign the strongest resonances to single amino acids by comparison with model peptides.
It could be shown in this thesis, that the developed perfusion system has a wide range of applications for different cell types. This system can therefore contribute to get a better understanding of the metabolism of tumor and stem cells and to generate biomarkers for differentiation of various cell types or for treatment response.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 15:41
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