| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen mit Print on Demand (86MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-367955
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.36795
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 11 Januar 2019 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Michael M. Nevels |
| Tag der Prüfung: | 12 Januar 2018 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene |
| Stichwörter / Keywords: | HCMV, IE1, CTD, Chromatin, Latency, DNA Damage Response |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 36795 |
Zusammenfassung (Englisch)
Human cytomegalovirus (hCMV), one of eight human herpesviruses, establishes lifelong "latent" infections in 40-100% of people worldwide. HCMV replication following primary infection or reactivation is known for causing developmental defects in human embryos and life-threatening disease in immunocompromised individuals, but preventive and therapeutic options are still limited. One potential ...
Zusammenfassung (Englisch)
Human cytomegalovirus (hCMV), one of eight human herpesviruses, establishes lifelong "latent" infections in 40-100% of people worldwide. HCMV replication following primary infection or reactivation is known for causing developmental defects in human embryos and life-threatening
disease in immunocompromised individuals, but preventive and therapeutic options are still limited. One potential candidate for the development of new antiviral drugs or a vaccine is the immediate-early (IE) 1 protein of hCMV. This protein is a crucial regulator of viral and cellular gene expression and has been shown to interact with chromatin. For chromatin binding, the IE1 protein exhibits two adjacent core histone interacting regions with distinct binding specificities. One of them is the so-called "chromatin tethering domain" (CTD), a 16 amino-acid sequence
(amino acids 476-491) at the IE1 carboxy-terminus, which was recently shown to bind to the acidic patch formed by histone H2A and H2B on the nucleosomal surface to which several other viral and cellular proteins bind as well. The latency-associated nuclear antigen 1 (LANA) encoded by the Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) binds to the acidic patch in a way similar to the IE1-CTD and was shown to regulate chromatin compaction, viral genome maintenance and the cellular DNA damage response (DDR) via this interaction. Based on the similarities to LANA and the fact that nucleosome targeting by IE1 is dispensable for productive
replication of hCMV, we hypothesized that the two viral proteins may serve analogous functions during latency of their respective viruses. In this thesis, I focused on defining chromatin binding sites of IE1 and uncovering the function of nucleosome targeting by IE1 with respect to genome
maintenance and DDR. To identify chromatin binding sites of IE1 on both the viral and cellular genome, I generated primary human fibroblasts (MRC-5 cells) permissive to hCMV in which
expression of HA-tagged IE1, untagged IE1, and HA-tagged CTD-deleted IE1 (IE1₁₋₄₇₅) can be synchronously induced. Chromatin immunoprecipitation coupled to next generation sequencing (ChIP-seq) experiments using these cells revealed that IE1 broadly binds to the host genome in a CTD-dependent manner. The protein appears to be enriched at transcription end sites (TES) and excluded from the promoter regions of human genes at the transcription start sites (TSS),
which may be due to differences in the nucleosomal load at these sites. Broad binding of IE1 was also observed across the viral genome, but here four binding peaks were identified. During viral latency IE1 may use nucleosome binding as a mechanism to tether the viral genome to host chromosomes similar to what has been observed for LANA. Against all controversies regarding the presence of IE1 during non-productive stages of infection, I could identify full-length IE1mRNA and protein and IE2 protein in a latently hCMV-infected monocytic cell line (THP-1 cells). Time-course analysis of viral genome levels in these cells showed that chromatin binding by IE1 is necessary for cyclic viral DNA replication events during latency through which the virus probably ensures viral genome maintenance. Other results demonstrate that IE1 reduces the nucleosomal load on the viral and host genome in a CTD-independent manner, perhaps to reduce chromatin compaction and promote transcription. Similar to LANA, chromatin binding by IE1 also affects the DDR outcome. IE1 blocks H2A(X)K13/15 and H2A(X)K118/119
ubiquitination by binding to the nucleosomal acidic patch and thereby seems to diminish DNA double-strand break repair by non-homologous end joining. These results indicate that IE1
broadly interacts with viral and cellular chromatin via the nucleosome surface and suggest that the IE1-nucleosome interaction serves an important role in controlling viral genome maintenance and the outcome of the DDR in hCMV-infected cells.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Das humane Cytomegalievirus (hCMV), eines von acht humanen Herpesviren, etabliert lebenslange "latente" Infektionen in 40-100% der Weltbevölkerung. Die hCMV-Replikation nach Primärinfektion oder Reaktivierung ist ursächlich für Entwicklungsdefekte bei menschlichen Embryonen und lebensbedrohlichen Krankheiten in immungeschwächten Personen, jedoch sind die präventiven und therapeutischen ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Das humane Cytomegalievirus (hCMV), eines von acht humanen Herpesviren, etabliert lebenslange "latente" Infektionen in 40-100% der Weltbevölkerung. Die hCMV-Replikation nach Primärinfektion oder Reaktivierung ist ursächlich für Entwicklungsdefekte bei menschlichen Embryonen und lebensbedrohlichen Krankheiten in immungeschwächten Personen, jedoch sind die präventiven und therapeutischen Möglichkeiten immer noch begrenzt. Ein potentieller Kandidat für die Entwicklung neuer antiviraler Medikamente oder eines Impfstoffs ist das immediate-early (IE) 1 Protein von hCMV. Dieses Protein ist ein wichtiger Regulator der viralen und zellulären Genexpression und interagiert bekanntermaßen mit Chromatin. Für die Chromatinbindung besitzt das IE1-Protein zwei benachbarte Histon-Bindedomänen mit unterschiedlichen Bindungsspezifitäten. Eine davon ist die sogenannte "Chromatin tethering domain" (CTD), eine Sequenz aus 16 Aminosäuren (Aminosäuren 476-491) am Carboxyterminus
von IE1, für die kürzlich gezeigt wurde, dass sie an die durch Histon H2A und H2B gebildete saure Tasche auf der nukleosomalen Oberfläche bindet, mit der auch mehrere andere virale und zelluläre Proteine interagieren. Das Latenz-assoziierte nukleäre Antigen 1 (LANA) des Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus (KSHV) bindet ähnlich wie die IE1-CTD in die saure Tasche und reguliert über diese Interaktion die Chromatinkondensation, die virale Genomerhaltung und die zelluläre DNA-Schadensantwort. Basierend auf den Ähnlichkeiten zu LANA und der Tatsache, dass die IE1-Nukleosomenbindung keine Rolle für die produktive
Replikation von hCMV zu spielen scheint, vermuteten wir, dass die beiden viralen Proteine analoge Funktionen während der Latenz ihrer jeweiligen Viren übernehmen. Der Fokus dieser
Arbeit lag auf der Identifizierung von Chromatinbindestellen des IE1-Proteins und der Funktion der IE1-Nukleosomenbindung hinsichtlich Genomerhaltung und DNA-Schadensantwort. Um Chromatinbindestellen von IE1 sowohl im viralen als auch im zellulären Genom zu identifizieren,
stellte ich hCMV-permissive primäre humane Fibroblasten (MRC-5 Zellen) her, in denen die Expression von HA-markiertem IE1, unmarkiertem IE1 und HA-markiertem CTD-deletiertem IE1 (HA-IE1₁₋₄₇₅) synchron induziert werden kann. Chromatin-Immunpräzipitation kombiniert mit Next Generation Sequencing (ChIP-seq) in diesen Zellen zeigte, dass IE1 in Abhängigkeit der CTD breit verteilt über das Wirtsgenom bindet. Das Protein scheint an den
Transkriptionsendstellen (TES) angereichert und von den Promotorregionen humaner Gene an den Transkriptionsstartstellen (TSS) abgereichert zu sein, was auf Unterschiede in der nukleosomalen Besetzung an diesen Stellen zurückzuführen sein könnte. Die IE1-Bindung im viralen Genom war ebenfalls breit verteilt, jedoch wurden hier vier prominente Anreicherungsstellen identifiziert. Während der viralen Latenz nutzt IE1 die Nukleosomenbindung möglicherweise als Mechanismus, um das virale Genom an die Chromosomen des Wirts zu heften, ähnlich wie es für LANA beobachtet wurde. Ungeachtet aller Kontroversen hinsichtlich der Anwesenheit von IE1 während der nicht-produktiven Infektion, konnte ich in einer latent hCMV-infizierten
monozytischen Zelllinie (THP-1-Zellen) Volllänge-IE1-mRNA und -Protein sowie IE2-Protein identifizieren. Eine Zeitverlaufsanalyse der viralen Genommengen in diesen Zellen zeigte, dass die IE1-Chromatinbindung für zyklische virale DNA-Replikationsereignisse während der Latenz erforderlich ist, durch die das Virus wahrscheinlich die virale Genomerhaltung sicherstellt. Andere Ergebnisse zeigen, dass IE1 die Nukleosomenbesetzung am Virus- und Wirtsgenom in CTD-unabhängiger Weise reduziert, möglicherweise um die Chromatinkondensation zu reduzieren und damit die Transkription zu fördern. Ähnlich wie bei LANA beeinflusst
die Chromatinbindung durch IE1 auch das Ergebnis der DNA-Schadensantwort. IE1 blockiert die H2A(X)K13/15- und H2A(X)K118/119-Ubiquitinierung durch Bindung in die saure
Tasche und scheint damit die DNA-Doppelstrangbruchreparatur durch nicht-homologe Endverknüpfung zu behindern. Diese Ergebnisse zeigen, dass IE1 großflächig mit dem viralen und zellulären Chromatin über die Nukleosomenoberfläche interagiert und deuten darauf hin, dass die IE1-Nukleosomenbindung eine wichtige Rolle bei der Erhaltung viraler Genome und der DNA-Schadensantwort in hCMV-infizierten Zellen spielt.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 20:17
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