In Drosophila melanogaster, the protein Sxl Lethal (Sxl) is the master regulator of female development, controlling sex-specific differences in morphology, behaviour and dosage
compensation. The female-specific protein is involved in a variety of posttranscriptional regulatory pathways, which have been intensively studied during the past decades. In contrast, the molecular function of its ...
Abstract (English)
In Drosophila melanogaster, the protein Sxl Lethal (Sxl) is the master regulator of female development, controlling sex-specific differences in morphology, behaviour and dosage
compensation. The female-specific protein is involved in a variety of posttranscriptional regulatory pathways, which have been intensively studied during the past decades. In contrast, the molecular function of its closely related paralog Sister-of-Sex-Lethal (Ssx) had not been elucidated. Despite their high sequence similarity, the two proteins exhibit surprising functional differences. Here we show that, unlike Sxl, Ssx is expressed in both sexes. Applying iCLIP analyses, we further determine the RNA targets of Ssx and demonstrate that the protein binds to an RNA sequence motif that is highly similar to the motif recognized by Sxl. Both proteins can recognize and bind to sequence elements previously shown to function in the regulation of alternative splicing and translational control. Using two model substrates, the male-specific lethal-2 (msl-2) and Sxl RNAs, we addressed the role of Ssx in post-transcriptional regulation of gene expression and its functional interplay with Sxl. To establish and to maintain its continuous expression in female flies, Sxl establishes an auto-regulatory, positive feedback loop by promoting constitutive splicing of its own primary transcript. Binding to several intronic RNA sequences, Sxl acts as an inhibitor of splicing that prevents inclusion of an exon with a premature termination codon in the mature mRNA. We demonstrate that Ssx can compete with Sxl for binding to these regulatory RNA elements. By this, Ssx can function as a competitive inhibitor of the Sxl auto-regulatory feedback loop in cultured cells. In line with this finding, male flies that lack Ssx protein exhibit aberrant Sxl expression. In contrast to alternative splicing in which Ssx functions as an antagonist of Sxl function, both
proteins can act as inhibitors of translation. For translational control of msl-2 mRNA, Sxl employs two previously characterized pathways that operate via binding sites in either the 5’ or 3’ UTR of the RNA. Ssx recapitulates 5’UTR-mediated translational repression, however, it does not exhibit regulatory activity when operating via the 3’UTR-mediated regulation. A thorough mutagenesis reveals that this difference in activity is based on three amino acid
substitutions, allowing deep insights into the recent evolutionary history and functional diversification of the two proteins. In sum, our studies reveal the molecular function of Ssx and unravel a surprisingly complex interplay between the two closely-related proteins in sex-specific development of Drosophila.
Translation of the abstract (German)
Das RNA Bindeprotein Sex Lethal (Sxl) ist der Hauptregulator der weiblichen Fliegenentwicklung in Drosophila melanogaster, indem es die geschlechtsabhängige Morphologie und das Verhalten reguliert und die Dosiskompensation kontrolliert. Das Weibchen-spezifische Protein wirkt in einer Vielzahl von post-transkriptionellen
Mechanismen, welche über die letzten Jahrzehnte intensiv untersucht worden ...
Translation of the abstract (German)
Das RNA Bindeprotein Sex Lethal (Sxl) ist der Hauptregulator der weiblichen Fliegenentwicklung in Drosophila melanogaster, indem es die geschlechtsabhängige Morphologie und das Verhalten reguliert und die Dosiskompensation kontrolliert. Das Weibchen-spezifische Protein wirkt in einer Vielzahl von post-transkriptionellen
Mechanismen, welche über die letzten Jahrzehnte intensiv untersucht worden sind. Im Gegensatz zu Sxl, ist die Funktion des nah verwandten Paralogs Sister-of-Sex-Lethal (Ssx) weitgehend unbekannt. Trotz ihrer hohen Sequenzähnlichkeit weisen beide Proteine große funktionelle Unterschiede auf. In dieser Arbeit zeigen wir, dass Ssx, im Gegensatz zu Sxl, in
beiden Geschlechtern exprimiert wird. ICLIP Analysen identifizierten von Ssx gebundene RNAs und bestätigten, dass Ssx RNA Sequenzen bindet, die den Sxl Bindemotiven stark
ähneln. Beide Proteine erkennen und binden Sequenzelemente, durch welche sie in der Regulation des alternativen Spleißens und der translationalen Kontrolle von Bedeutung sind. Unter Verwendung von zwei Modelsubstraten, male-specific lethal-2 (msl-2) und Sxl mRNA, analysierten wir die Rolle von Ssx innerhalb der post-transkriptionellen Regulation der Genexpression und dessen funktionelles Zusammenspiel mit Sxl. Um eine kontinuierliche Expression in weiblichen Fliegen zu garantieren, etabliert Sxl eine
autoregulatorische positive Rückkopplung, welche ein konstitutives Spleißmuster des eigenen primären Transkripts gewährleistet. Dabei bindet Sxl an mehrere intronische RNA
Sequenzen und verhindert als Spleißinhibitor die Inklusion eines Exons in die reife Sxl mRNA, welche sonst für ein verfrühtes Terminationskodon kodieren würde. In diesem
Zusammenhang konnten wir zeigen, dass Ssx mit Sxl um die Bindung an diese regulatorischen RNA Elemente kompetitiert. Somit kann Ssx in männlichen Zellen als kompetitiver Inhibitor der Sxl autoregulatorischen Rückkopplung funktionieren. Im Einklang mit diesen Ergebnissen konnten wir ebenfalls beweisen, dass der Verlust von Ssx in männlichen Fliegen zu einer aberranten Sxl Expression führt. Im Gegensatz zum alternativen Spleißen, in welchem Ssx als Antagonist der Sxl Funktion agiert, können beide Proteine Translation inhibieren. Sxl verfügt über zwei gut charakterisierte Mechanismen, um die Translationskontrolle von msl-2 zu gewährleisten. Diese Regulation beruht auf Bindestellen innerhalb der 5’UTR oder innerhalb der 3’UTR der msl-2 mRNA. Ssx reprimiert die Translation innerhalb des 5’UTR vermittelten Mechanismus,
zeigt jedoch keine regulatorische Aktivität innerhalb der 3’UTR vermittelten Regulation. Detaillierte Mutageneseanalysen des Proteins ergaben, dass der Aktivitätsunterschied auf drei Aminosäuren zurückzuführen ist. Diese Erkenntnis erlaubte tiefe Einsichten in die
evolutionäre Beziehung und die funktionelle Diversifikation der zwei Proteine. Zusammengefasst konnten wir die molekulare Funktion von Ssx aufzeigen und das
überraschend komplexe Zusammenspiel der zwei nah verwandten Paraloge in der geschlechtsabhängen Fliegenentwicklung darlegen.
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