| License: Creative Commons Attribution 4.0 (3MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-374392
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.37439
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 12 July 2018 |
| Referee: | Prof. Dr. Peter Angele |
| Date of exam: | 27 June 2018 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Unfallchirurgie |
| Keywords: | Tissue Engineering, Hyaluronsäure-Gelatine-Kompositmatrix, hyaluronan-ester/gelatin composite scaffold, Meniskus, meniscus, Gelatine, gelatin, Transglutaminase, Quervernetzung, crosslinking, Kälteexposition, cold exposure, Mesenchymale Stammzellen, mesenchymal stem cells |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 37439 |
Abstract (German)
Das Tissue Engineering im Bereich avaskulärer Meniskusläsionen beinhaltet eine in vitro Kultivierung und Differenzierung von autologen Zellen in einem Scaffold und die anschließende Implantation in den Meniskusdefekt. Eine im eigenen Labor als solches Scaffold entwickelte Hyaluronsäure-Gelatine-Komposit-Matrix soll durch zusätzliches Einbringen von Gelatine und Transglutaminase mechanisch ...
Abstract (German)
Das Tissue Engineering im Bereich avaskulärer Meniskusläsionen beinhaltet eine in vitro Kultivierung und Differenzierung von autologen Zellen in einem Scaffold und die anschließende Implantation in den Meniskusdefekt.
Eine im eigenen Labor als solches Scaffold entwickelte Hyaluronsäure-Gelatine-Komposit-Matrix soll durch zusätzliches Einbringen von Gelatine und Transglutaminase mechanisch stabilisiert werden.
Zur Messung der Stabilität der mit Transglutaminase enzymatisch quervernetzten Gelatine bestimmten wir unter anderem einen Wert für die Arbeit zur Kompression des Gels in einer Well-Platte mit Hilfe eines umfunktionierten Infusiomaten und eines ausgesuchten Stempels. Außerdem erfolgten Kompressionen von freien Gel-Zylindern und Matrices – bei Messung der Matrices zusätzlich auch Zugbelastungen.
Zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität bevorzugten wir eine Fluoreszenz-Messung mit Kasein und Dansylcadaverin als Substrate. Unter Verwendung einer Meerschweinchentransglutaminase von Sigma als Standardtransglutaminase konnten wir die Aktivität der Transglutaminasen dosieren und unter verschiedenen Einflussfaktoren überprüfen.
Für die meisten mechanischen Versuche verwendeten wir eine bakterielle Transglutaminase von Ajinomoto.
Um eine möglichst feste Gelstruktur herzustellen, erwies es sich als vorteilhaft, die enzymatische Quervernetzung für mindestens 24 Stunden bei 4 °C stattfinden zu lassen.
Eine bis zu 24-stündige Kälteexposition der mesenchymalen Stammzellen in Form einer 3-D-Kultur in der quervernetzten Gelatine stellte bei 28-tägiger Nachbeobachtung keine relevante negative Auswirkung auf die Überlebensrate und das metabolische Wachstum dar. Eine Zellproliferation zeigte sich bei allen Gruppen unabhängig von der Kälteexposition kaum. Die Zellmorphologie zeigte die Ausbildung von Pseudopodien. Nach 28 Tagen ergaben sich Hinweise für eine osteogene Differenzierung. Insgesamt konnten die Zellen gut und in homogener Anordnung in der Gelatine stabilisiert werden.
Weitere Einflussfaktoren, wie die Konzentrationen der Gelatine, der Transglutaminase, des bei Ajinomoto enthaltenden Maltodextrin-Zucker und des fetalen bovinen Serum zeigten bei höheren Konzentrationen keine negativen, sondern zum Teil sogar positive Auswirkungen auf Zellvitalität und –wachstum.
Das Einbringen einer Gelatine-Transglutaminase-Lösung in die Poren der Hyaluronsäure-Gelatine-Komposit-Matrix und die anschließende Inkubation bei 4°C zeigte eine erhebliche Verbesserung der mechanischen Stabilität bei Kompression und Zugbelastung, sogar noch verstärkt durch zusätzliche Vorbehandlung der Matrices mit Transglutaminase, so dass eine zusätzliche Dosis von Transglutaminase an die Matrix vorweg adhärieren konnte.
Bei Kompressionen konnte etwa eine Verzehnfachung des E-Modul erreicht werden. Die maximale Zugbelastung konnte ungefähr verdoppelt werden. Die Zugdehnung wurde ebenfalls verbessert.
Insgesamt konnte festgehalten werden, dass durch die Einbringung von quervernetzter Gelatine eine Verbesserung von Materialeigenschaften gelang, die bei den herkömmlichen Matrices unbefriedigend waren.
Höhere Konzentrationen von Gelatine und Transglutaminase als die von uns gewählten maximalen Konzentrationen von 5% bzw. 3 U/ml wären wünschenswert, stellten allerdings ein Handhabungsproblem dar, insbesondere in Bezug auf das rechtzeitige Einbringen der Gelatine-Transglutaminase-Lösung in die Matrix vor dem Zäh-Werden und schließlich Hart-Werden der Lösung.
Translation of the abstract (English)
Tissue engineering in the field of avascular meniscal lesions involves in vitro culturing and differentiation of autologous cells in a scaffold and subsequent implantation into the meniscal defect. An in-house developed hyaluronan-ester/gelatin composite scaffold is supposed to be mechanically stabilized by incorporation of gelatin and transglutaminase, an enzyme crosslinking gelatin. To ...
Translation of the abstract (English)
Tissue engineering in the field of avascular meniscal lesions involves in vitro culturing and differentiation of autologous cells in a scaffold and subsequent implantation into the meniscal defect.
An in-house developed hyaluronan-ester/gelatin composite scaffold is supposed to be mechanically stabilized by incorporation of gelatin and transglutaminase, an enzyme crosslinking gelatin.
To measure the stability of enzymatically cross-linked gelatin, we determined, inter alia, a value for the work of compressing the gel in a well plate with the aid of a converted infusion pump and a selected punch. Furthermore, compressions of freestanding gel cylinders and scaffolds were accomplished - in addition, tensile loads were also measured when measuring the scaffolds.
To determine the enzymatic activity, we preferred a fluorescence measurement with casein and dansylcadaverine as substrates. Using a guinea pig transglutaminase from Sigma as a standard transglutaminase, we were able to dose the activity of the transglutaminases and check them under different influencing factors.
For most mechanical experiments, we used a bacterial transglutaminase from Ajinomoto.
In order to produce a firm gel structure as possible, it was advantageous to let the enzymatic cross-linking take place for at least 24 hours at 4 °C.
Cold exposure to mesenchymal stem cells for up to 24 hours in the form of a 3-D culture in cross-linked gelatin did not relevantly affect survival and metabolic growth at 28-days follow-up. Cell proliferation was barely in all groups, cold exposure notwithstanding. The cell morphology showed the formation of pseudopodia. After 28 days there was evidence of osteogenic differentiation. Overall, the cells could be stabilized well and in a homogeneous arrangement in the gelatin.
Other influencing factors, such as the concentrations of gelatin, transglutaminase, maltodextrin sugar contained in Ajinomoto, and fetal bovine serum did not show any negative but particularly positive effects on cell viability and growth at higher concentrations.
The incorporation of a gelatin-transglutaminase solution into the pores of the hyaluronan-ester/gelatin composite scaffold and the subsequent incubation at 4 ° C showed a considerable improvement in the mechanical stability in compression and tensile loading, further enhanced by additional pretreatment of the scaffolds with transglutaminase, so that an additional dose of transglutaminase could adhere to the scaffold in advance.
For compressions, a tenfold increase in the modulus of elasticity was achieved. The maximum tensile load was approximately doubled and the tensile elongation also improved.
In total, it can be noted that incorporation of crosslinked gelatin has improved material properties that have been unsatisfactory with conventional scaffolds.
Higher concentrations of gelatin and transglutaminase than our chosen maximum concentrations of 5% and 3 U/ml, respectively, would be desirable but presented a handling problem, especially with regard to the timely incorporation of the gelatin-transglutaminase solution into the scaffold before toughening gelation of the solution.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 19:36
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