| License: Creative Commons Attribution 4.0 (7MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-374959
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.37495
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 19 June 2019 |
| Referee: | Prof.Dr Marina Kreutz and Prof.Dr Wolfgang Müller-Klieser and Prof. Dr Wolfram Gronwald and Prof. Dr Richard Warth and Prof. Dr Stephan Schneuwly |
| Date of exam: | 18 June 2018 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Innere Medizin III (Hämatologie und Internistische Onkologie) |
| Keywords: | 2-Hydroxyglutarate, Dendritic Cells, Metabolism |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 37495 |
Abstract (English)
Tumor development is commonly associated with genetic alterations such as activation of oncogenes or the silencing of tumor suppressor genes. Recently point mutations in genes encoding isocitrate dehydrogenase (IDH) have gained substantial interest in glioma classification. IDH mutations are also frequently found in neoplasias including acute myeloid leukemia (AML). Mutated IDH aquires the ...
Abstract (English)
Tumor development is commonly associated with genetic alterations such as activation of oncogenes or the silencing of tumor suppressor genes. Recently point mutations in genes encoding isocitrate dehydrogenase (IDH) have gained substantial interest in glioma classification. IDH mutations are also frequently found in neoplasias including acute myeloid leukemia (AML). Mutated IDH aquires the function to produce the oncometabolite D-2-hydroxyglutarate (D-HG). D-HG levels in the tissue of glioma patients can reach concentrations up to 35mM. Nevertheless, little is known on the impact of D-HG on non-malignant human immune cells.
In the present work, we compared the effect of both HG enantiomers, D-HG and L-2-Hydroxyglutarate (L-HG) on dendritic cell (DC) maturation and activation, and found similar effects with both enantiomers. We also analyzed the impact of D-HG on the respiration of DCs and two glioblastoma cell lines.
We found that D-HG was taken up by LPS-stimulated DCs. Furthermore, the presence of D-HG during maturation and activation of DCs strongly affected the production of IL-12. Especially when DCs were treated with D-HG during the entire maturation process, the IL-12 production was extremely reduced.
To elucidate the mechanism by which D-HG modulates IL-12 production, we studied the principal components of the Toll-like receptor 4 signaling pathway involved in IL-12 p70 production (NF-κB, HIF-α, PI3-kinase pathway components). However, we found no significant effect of D-HG treatment on any of these pathways after 1hr or 24hrs of incubation. As we found an increase of GPR109A expression after LPS stimulation, we studied a possible involvement of this receptor but found no significant relation between IL-12 production and the reported GPR109A ligand, niacin.
Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) has been described to be involved in DC function. We found significant reduction of IL-12 production by the treatment of DCs with cAMP and the cAMP-inducing-factor forskolin. However, due to technical problems, we could not detect cAMP in DCs. As several reports state a possible relation between cAMP signaling pathways and mitochondrial respiration, we analyzed the impact of D-HG on mitochondrial respiration of LPS-stimulated DCs. We observed an inhibition of routine respiration caused by LPS, whereas pre-treatment with D-HG blocked this LPS effect. As treatment with oligomycin and rotenone (inhibitors of mitochondrial respiration) did not recover IL-12 suppression, the impact of HG on respiration alone is not sufficient to explain the suppressive effect of HG.
To further analyze the effect of D-HG on mitochondrial respiration we utilized an inhibitor of mitochondrial calcium efflux, cyclosporine A (CsA). We noticed an increase of IL-12 levels after CsA treatment compared with DCs activated without CsA treatment. Combination of CsA and D-HG in LPS-stimulated DCs partially rescued IL-12 levels caused by D-HG treatment. During high resolution respirometry studies we observed a delayed reduction of routine respiration 2hrs after CsA treatment. Also, we found a modest increase of respiratory chain complex expression in stimulated DCs treated with D-HG (complex I and II). Moreover, lactate secretion studies showed an increase of lactate levels by LPS. D-HG was able to block this increase. These observations point towards the capacity of D-HG to interfere with the metabolic shift from oxidative phosphorylation into glycolysis promoted by LPS. This could also explain the suppressive effect of D-HG on IL-12 production.
IDH mutations are associated with glioma development and prognosis. Nevertheless the effect of D-HG on mitochondrial respiration of glioma cell lines is poorly documented. In the present work, we found no consistent effect on mitochondrial respiration by D-HG in two glioma cell lines.
Furthermore, we investigated global effects of HG on DCs by RNAseq analyses. Surprisingly most genes were similarily regulated by HG and our control substance di-ketoglutarate most likely due to its close structural similarity. Only 6 genes were upregulated and 3 genes were downregulated by HG. Further investigations have to be performed to investigate the link between the identified genes and DC function.
Translation of the abstract (German)
Tumoren werden durch Mutationen in Protoonkogenen und Tumorsurpressorgenen verursacht. Diese Mutationen führen entweder zur Aktivierung von Onkogenen oder zum Stilllegen von Tumorsupressorgenen. Aktuell wurden Punktmutationen im Gen der Isocitrat-Dehydrogenase (IDH) für die Klassifizierung von Gliomen beschrieben. IDH Mutationen werden neben dem Gliom, häufig in der Akuten myeloischen Leukämie ...
Translation of the abstract (German)
Tumoren werden durch Mutationen in Protoonkogenen und Tumorsurpressorgenen verursacht. Diese Mutationen führen entweder zur Aktivierung von Onkogenen oder zum Stilllegen von Tumorsupressorgenen. Aktuell wurden Punktmutationen im Gen der Isocitrat-Dehydrogenase (IDH) für die Klassifizierung von Gliomen beschrieben. IDH Mutationen werden neben dem Gliom, häufig in der Akuten myeloischen Leukämie gefunden. Durch die Mutation bekommt die IDH die Fähigkeit D-2-hydroxygluterat (D-HG) zu produzieren. D-HG kann im Tumorgewebe von Gliom Patienten eine Konzentration bis zu 35mM erreichen. Der Effekt von D-HG auf humane Immunzellen ist bisher wenig untersucht.
In dieser Arbeit wurde der Einfluss von D-HG auf die Reifung und Aktivierung von dendritischen Zellen (DCs) untersucht und mit der Wirkung des Enantiomers L-HG verglichen. Die Effekte beider Enantiomere waren vergleichbar. Außerdem wurde der Einfluss von D-HG auf die Atmung von DCs und zwei Glioblastom Zelllinien untersucht. Zuerst bestätigten wir das D-HG von LPS aktivierten DCs aufgenommen wird. Des Weiteren sahen wir eine stark reduzierte IL-12 Produktion in DCs, wenn D-HG während der Reifung präsent war.
Um den Mechanismus des Effekts von D-HG auf die IL-12 Produktion zu analysieren, wurden zentrale Proteine des Toll-like Rezeptors (TLR) 4 Signalwegs, die bei der IL-12 p70 Produktion beteiligt sind (NF-κB, HIF-α, PI3-kinase Signalweg), untersucht. Jedoch zeigte D-HG weder nach 1 Stunde noch nach 24h einen signifikanten Effekt auf die Aktivität oder Menge der untersuchten Proteine. Die Aktivierung von DCs mit LPS führte auch zu einer erhöhten Expression des G Protein gekoppelten Rezeptors GPR109A, aber auch hier konnte kein Zusammenhang mit dem IL-12 supprimierenden Effekt von D-HG hergestellt werden, da Niacin, ein GPR109A Ligand keinen Einfluss auf die IL-12 Produktion hatte.
Cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) ist ein wichtiger sekundärer Botenstoff der als wichtig für die DC Funktion beschrieben wurde. Die Behandlung von DCs mit cAMP und Foskolin, einem cAMP-induzierenden Faktor führte zu einer signifikanten Reduktion der IL-12 Produktion. Einige Arbeitsgruppen beschreiben einen Zusammenhang zwischen cAMP Signalweg und der Atmung, deshalb wurde der des Weiteren der Einfluss von D-HG auf die Atmung von DCs untersucht. LPS reduzierte die basale Atmung, diese Reduktion konnte durch eine D-HG Vorinkubation blockiert werden. Allerdings kam es durch die Behandlung mit Oligomycin und Rotenon (Inhibitoren der Atmungskette) zu keiner Erhöhung der verminderten IL-12 Produktion.
Um den Einfluss von D-HG auf die Atmung weiter zu charakterisieren wurden DCs mit Cyclosporin A (CsA) behandelt. CsA inhibiert den Transport von Calcium aus dem Mitochondrium. CsA erhöhte die IL-12 Produktion im Vergleich zur IL-12 Produktion nach Aktivierung mit LPS alleine. Auch in Kombination mit D-HG war die IL-12 Produktion höher als nur mit D-HG. CsA führte außerdem zu einer verspäteten Reduktion der basalen Atmung nach 2 Stunden.
Des Weiteren wurde die Expression der Atmungsketten Komplexe mittels Western Blot untersucht. Komplex I und II waren vermehrt in D-HG behandelten DCs messbar. Um den Effekt von D-HG auf den Metabolismus weiter zu untersuchen wurde die Laktatkonzentration im Überstand bestimmt. LPS führte zu einer Erhöhung der Laktatlevel, D-HG war in der Lage diese Erhöhung zu Blockieren. Diese Beobachtung weist darauf hin, dass D-HG fähig war, die durch LPS induzierte metabolische Umstellung von oxidative Phosphorylierung hin zur Glykolyse zu beeinflussen. Dies könnte auch die verminderte IL-12 Produktion erklären, da die metabolische Umstellung für die Aktivierung eine Rolle spielen könnte.
Weiterhin wurde der Effekt von D-HG auf die Atmung von Gliom Zelllinien untersucht. In dieser Arbeit fanden wir keinen konsistenten Effekt von D-HG auf die Atmung von U87 Zellen und TP365,
In weiteren Analysen wurde mittels RNAseq Effekte von HG auf die Genexpression von DCs untersucht. Es zeigte sich, dass HG und di-Ketoglutarat weitestgehend vergleichbare Veränderungen in der Genexpression induzieren. Dies hängt wahrscheinlich damit zusammen, dass diese beiden Substanzen chemisch eng verwandt sind. Allerdings wurden durch HG 6 Gene hochreguliert und 3 Gene supprimiert, die nicht durch Ketoglutarat reguliert waren. In weiteren Untersuchungen muss der Zusammenhang zwischen der DC Funktion und diesen Genen analysiert werden.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 19:31
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