Abstract (English)
The aim of my work was to design new low-cost optical luminescent pH sensor membranes and a sensor microtiterplate containing lanthanide complexes for continuous quantitation of pH over a wide range. These sensors should overcome the typical drawbacks of classical optical indicator dyes with a dynamic range of up to 3 pH units only (due to the mass action law) and of electrochemical sensors ...
Abstract (English)
The aim of my work was to design new low-cost optical luminescent pH sensor membranes and a sensor microtiterplate containing lanthanide complexes for continuous quantitation of pH over a wide range. These sensors should overcome the typical drawbacks of classical optical indicator dyes with a dynamic range of up to 3 pH units only (due to the mass action law) and of electrochemical sensors which cannot be miniaturized to µm-size or enable imaging over larger areas (e.g. in cell culture). We therefore introduced a new design concept for wide-range pH indicators and sensors that employs lanthanide complexes with ligands that have various pKas. Hence, a wider pH range becomes accessible.
First, we complexed europium with three different ligands with various pKas to form an indicator. These ligands are Gallic acid (Gall) a trihydroxybenzoic type of phenolic acid that can strongly coordinate to Eu3+ ions via the carboxylic acid groups and has pKa1 = 4.5 and pKa2 = 10. Pyridine-2,6-dicarboxylic acid (PDA) is the second ligand that has pKa1 = 2.16 and pKa2 = 2.8. 2-Thenoyl trifloroacetone (TTA) with a pKa of 5.61 is the third ligand that is coordinated to Eu3+ ions. TTA is captures excitation light and efficiently transfers it to Eu3+ inducing a strong luminescence. We found that the Eu-TTA-PDA-Gall complex in a feed ratio (1:3:1:1) in aqueous buffer delivers a high luminescence emission that is dependent on pH over up to 8 orders of magnitude from pH 2–10 in aqueous solution. This is a unique pH response for a single indicator molecule. It was therefore embedded into a suitable polymeric membrane made from cellulose acetate (CA) in DMF in order to obtain pH sensor membranes. We found a reversible response of the emission intensity of the sensor membranes over a wide range of pH 2-pH 7 over 5 orders of magnitude within several minutes. Moreover, the first high-throughput pH sensor microtiterplate based on this indicator showed a dynamic range from pH 2–8 over 6 orders of magnitude and is suitable for up to 24 h of continuous use. The emission drop of the sensor membranes and of the microplate at high pH and the response time were improved by using thinner sensor foils of 30 µm instead of 60 µm. A response time down to 300 s was a chieved.
Further, we show a simpler lanthanide complex with only two different ligands having various pKas attached to the Eu3+ ion. This yields a pH indicator with the widest detection range obtained from with single molecule, so far. We attached 2-thenoyl trifluoroacetone as deprotonable antenna ligand and pyridine-2,6-dicarboxylic acid as bidentate aromatic ligand. A Eu-TTA-PDA complex feed ratio of 1:3:2 shows a wide-range luminescence response from pH 2-10. Embedding the indicator into a cellulose acetate polymeric membrane on a Mylar support yields a sensor membrane with a working range from pH 2-8. This detection range in a sensor membrane is one pH unit wider than described for the earlier complex. For high-throughput applications the sensor microtiterplate showed the same wide working range of pH 2-8 and operational stability over one day. The sensor microplate proved its applicability to various real samples (river waters, urine and others) with no pre-treatment by delivering pH values close to those acquired with a pH electrode as reference.
The advantage of the use of lanthanide complex indicators with ligands that have various pKas is that only one excitation and detection wavelength are required for detection of pH, unlike in other work where dye mixtures often require several excitation and emission readouts. This lower instrumental demand facilitates the pH readout and sensor integration into miniaturized devices. A further advantage is that the synthetic effort to obtain various ligands is much less compared to the many synthesis steps required to prepare several derivatives of the same class of dyes (to retain excitation and emission wavelengths) for multi-indicator sensors. Therefore, this multi-pKa-ligands-design scheme for pH indicators can open a gate for new luminescent wide-range optical pH indicators and sensors to widen the the sensing range of pH ever further towards pHs of either 0 or 14. However, this entails the challenge to find ligands with appropriate pKas that complex strongly enough to prevent dissociation at extreme pH.
Fabrication and use of new sensors and sensor microplates for ions in high throughput screening to monitor cell growth, cell status and cell toxicity could not be peformed any more due to time constraints.
Translation of the abstract (German)
Ziel der Arbeit was es, neue kostengünstige optische lumineszante-pH-Sensormembranen und eine Sensor-Mikrotiterplatte mit Lanthanoidkomplexen zur kontinuierlichen Quantifizierung des pH-Wertes über einen weiten Bereich zu entwickeln. Diese Sensoren sollen die typischen Nachteile klassischer optischer Indikatorfarbstoffe mit einem dynamischen Bereich von bis zu 3 pH-Einheiten (aufgrund des ...
Translation of the abstract (German)
Ziel der Arbeit was es, neue kostengünstige optische lumineszante-pH-Sensormembranen und eine Sensor-Mikrotiterplatte mit Lanthanoidkomplexen zur kontinuierlichen Quantifizierung des pH-Wertes über einen weiten Bereich zu entwickeln. Diese Sensoren sollen die typischen Nachteile klassischer optischer Indikatorfarbstoffe mit einem dynamischen Bereich von bis zu 3 pH-Einheiten (aufgrund des Massenwirkungsgesetzes) und elektrochemischen Sensoren überwinden, die nicht auf μm-Größe miniaturisiert werden können oder die lumineszenzauslesung über größere Flachen ermöglichen (z.B. in der Zellkultur). Wir haben daher ein neues Designkonzept für Indikatoren und Sensoren mit weitem pH-Bereich eingeführt, welches Lanthanoidkomplexe mit Liganden mit verschiedenen pKs-Werten verwendet. Dadurch wird ein breiterer pH-Bereich zugänglich.
Zunächst haben wir Europiumionen mit drei verschiedenen Liganden mit verschiedenen pKs-Werten zu einem Indikator komplexiert. Diese Liganden sind Gallussäure (Gall), eine Trihydroxybenzoesäure, die über die Carbonsäuregruppen stark an Eu3+-Ionen koordinieren kann und pKs1 = 4,5 und pKs2 = 10 aufweist. Pyridin-2,6-dicarbonsäure (PDA) ist der zweite Ligand und verfügt über pKs1 = 2,16 und pKs2 = 2,8. 2-Thenoyltrifluoraceton (TTA) mit einem pKs-Wert von 5,61 ist der dritte Ligand, der an Eu3+-Ionen koordiniert ist. TTA ist ein Antennenligand, der Anregungslicht einfängt und es effizient zu Eu3+ überträgt, wodurch eine starke Lumineszenz induziert wird. Wir haben herausgefunden, dass der Eu-TTA-PDA-Gall-Komplex in einem ligendenerhältnis (1:3:1:1) in wässrigem Puffer eine hohe Lumineszenzemission liefert, die in wässriger Lösung für bis zu 8 Größenordnungen eine pH-Abhängigkeit zwischen pH 2-10 besitzt. Dies ist ein einzigartigen pH-bereich für ein einzelnes Indikatormolekül. Es wurde daher in eine geeignete polymere Membran aus Celluloseacetat (CA) in DMF eingebettet, um pH-Sensormembranen zu generieren. Wir erhielten ein reversibles Signal der Emissionsintensität der Sensormembranen über einen weiten Bereich von pH 2-pH 7 über 5 Größenordnungen innerhalb von einigen Minuten. Darüber hinaus zeigte die erste Hochdurchsatz-pH-Sensor-Mikrotiterplatte auf Basis dieses Indikators einen dynamischen Bereich von pH 2-8 über 6 Größenordnungen und ist für bis zu 24 h Dauereinsatz geeignet. Der Emissionsabfall der Sensormembranen und der Mikroplatte bei hohem pH-Wert und die Ansprechzeit wurden durch Verwendung dünnerer Sensorfolien von 30 μm anstelle von 60 μm verbessert. Eine Ansprechzeit von bis zu 300 s wurde erreicht. Ferner Zeigen wir einen einfacheren Lanthanoidkomplex mit nur zwei verschiedenen Liganden, die verschiedene pKs-werte besitzen und an das Eu3+-Ion gebunden wurden. Dies ergibt einen pH-Indikator mit dem größten Detektionsbereich, der bisher mit einem einzelnen Molekül erzielt wurde. Wir haben 2-Thenoyltrifluoraceton als deprotonierbaren Antennenliganden und Pyridin-2,6-dicarbonsäure als zweizähnigen aromatischen Liganden gebunden. Ein Eu-TTA-PDA-Komplex-ligendenverhältnis von 1:3:2 wies eine Lumineszenzreaktion mit einem breiten Bereich von pH 2-10 auf. Die Einbettung des Indikators in eine Celluloseacetat-Polymermembran auf einem Mylar-Träger ergibt eine Sensormembran mit einem Arbeitsbereich von pH 2-8. Dieser Detektionsbereich in einer Sensormembran ist um eine pH-breiter weiter als für den früheren Komplex beschrieben. Für Hochdurchsatzanwendungen zeigte die Sensor-Mikrotiterplatte den gleichen breiten Arbeitsbereich von pH 2-8 und eine Betriebsstabilität über einen Tag. Die Sensor-Mikrotiterplatte hat ihre Anwendbarkeit fur verschiedene reale Proben (Flusswasser, Urin und andere) ohne Vorbehandlung bewiesen, indem pH-Werte geliefert wurden, die denen nahekommen, die mit einer pH-Elektrode als Referenz gemessen wurden. Der Vorteil der Verwendung von Lanthanoidkomplexindikatoren mit Liganden, die verschiedene pKs- werte aufweisen, besteht darin, dass nur eine Anregungs- und Detektionswellenlänge für die Detektion des pH-Wertes erforderlich ist (im Gegensatz zu anderen Veröffentlichungen, bei denen Farbstoffmischungen oft mehrere Anregungs- und Emissionsausgaben erfordern). Diese geringeren instrumentellen. Anforderungen erleichtert die pH-Auslesung und Sensorintegration in miniaturisierte Geräte. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass der synthetische Aufwand, um verschiedene Liganden zu erhalten, im Vergleich zu den vielen Syntheseschritten, die zur Herstellung mehrerer Derivate der gleichen Farbstoffklasse (um die Anregungs- und Emissionswellenlängen beizubehalten) für Mehrfachindikator-Sensoren nötig sind, viel geringer ist. Daher kann dieses Multi-pKs-Liganden-Design-Schema für pH-Indikatoren einen Zugang zu neuen lumineszierenden optische Weitbereichs-pH-Indikatoren und -Sensoren öffnen, um den Erfassungsbereich des pH immer weiter in Richtung pH-Werten von entweder 0 oder 14 zu erweitern. Dies bringt jedoch die Herausforderung mit sich, Liganden mit geeigneten pKs –werten zu finden, die stark genug komplexieren, um eine Dissoziation bei extremem pH zu verhindern.
Die Herstellung und Verwendung neuer Sensoren und Sensor-Mikroplatten für Ionen im Hochdurchsatz-Screening zur Überwachung des Zellwachstums, des Zellstatus und der Zelltoxizität konnte aufgrund von Zeitbeschränkungen nicht mehr durchgeführt werden.
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