| License: Creative Commons Attribution No Derivatives 4.0 (14MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-384181
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.38418
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 2 March 2020 |
| Referee: | Prof. Dr. Burkhard König |
| Date of exam: | 1 March 2019 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Organische Chemie > Lehrstuhl Prof. Dr. Burkhard König |
| Keywords: | Photoswitches, GPCR, Photopharmacology |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 38418 |
Abstract (German)
Diese Dissertation behandelt die Synthese, photophysikalische Charakterisierung und Anwendung von photochromen G-Protein gekoppelten Rezeptor-Liganden. Kapitel 1 beschreibt die Einbindung der bereits gut untersuchten Klassen der photochromen Dithienylethene und Fulgide in bekannte Dopamin-Rezeptor-Liganden wie 1,4-disubstituierte aromatische und Hydroxybenzoxazinon-Piperazine sowie Aminoindane. ...
Abstract (German)
Diese Dissertation behandelt die Synthese, photophysikalische Charakterisierung und Anwendung von photochromen G-Protein gekoppelten Rezeptor-Liganden.
Kapitel 1 beschreibt die Einbindung der bereits gut untersuchten Klassen der photochromen Dithienylethene und Fulgide in bekannte Dopamin-Rezeptor-Liganden wie 1,4-disubstituierte aromatische und Hydroxybenzoxazinon-Piperazine sowie Aminoindane. Es gelang, subtyp und funktionell selektive photochrome Liganden zu synthetisieren, welche mittels NMR-Spektroskopie und UV/VIS-Absorptionsspektroskopie charakterisiert wurden. Die photophysikalischen Eigenschaften der Dithienylethen Dopamin-Liganden wiesen eine hohe Ermüdungsresistenz in DMSO auf. Diese konnte in wässrigen Lösungen aufgrund des bekannten Twisted intramolecular charge transfer (TICT) jedoch nicht bestätigt werden. Einige Cyclopenten-Dithienylethene zeigten hohe photostationäre Zustände. Sie formten jedoch ein irreversibles Nebenprodukt, was den Abbau des Photoschalters zur Folge hatte. Bei Betrachtung der Fulgide konnten hohe photostationäre Zustände und eine Schaltbarkeit in polaren Lösungsmitteln festgestellt werden. Fulgimide mit Isopropyl-Rest wiesen ausschließlich eine Isomerisierung zwischen der offenen E-Form und der geschlossenen C-Form auf. Bei einer Konzentration von 1 nM zeigte ein offenes Isomer eines Cyclopenten-Dithienylethens eine 10-fach höhere Aktivierung des pharmakologisch bedeutenden D2S-Rezeptors als das geschlossene Isomer. Als alternativer Photoschalter wurde ein Indolyl-Fulgimid-Isomerenpaar (offen/geschlossen) entdeckt, dessen inverse Aktivierungs-eigenschaften im geschlossenen Zustand eine vierfach höhere Aktivität zeigte. Um die GPCR-regulierenden Photoschalter weiter zu optimieren und weitere biologische Erkenntnisse bezüglich des lichtinduzierten Schaltens am Rezeptor in vivo zu erhalten, müssen weitere Untersuchungen durchgeführt werden.
Das Kapitel 2 handelt von peptidischen photochromen Neuropeptid Y4-Rezeptor (NPY Y4-Rezeptor) Liganden. Der NPY Y4-Rezeptor ist ein G-Protein Protein-gekoppelter Rezeptor und bindet als natürlichen Liganden das pankreatischen Polypeptid, ein Homolog des NPY. Selektive Y4-Rezeptor Agonisten wurden zur Behandlung von Fettleibigkeit vorgeschlagen. Hochpotente dimere peptidische Y4-Rezeptor (Y4R)-Agonisten, die aus zwei durch einen aliphatischen Linker verbundenen Pentapeptid-Einheiten bestehen, repräsentieren eine interessante Klasse an Y4R-Liganden. Basierend auf dieser Ligandenklasse wurden photoempfindliche Y4R-Liganden mit Azobenzolen, Azopyrazolen, Dithienylethenen und Fulgimiden synthetisiert, um strukturelle Anforderungen solcher Y4R-Agonisten bezüglich der Y4R-Bindung zu untersuchen. Die synthetisierten Y4R-Liganden beinhalten einen starren nicht aliphatischen, photochromen Linker, der ein reversibles Schalten in wässrigem Puffer ermöglicht und durchwegs hohe Y4R-Affinitäten aufweist. Dies zeigt, dass der Austausch des hochflexiblen aliphatischen Linkers durch einen weniger flexiblen photochromen Linker bezüglich der Y4R-Bindung gut toleriert wird. Unterschiede in der Affinität und Aktivierung des Y4R zwischen den jeweiligen Photoisomeren, welche sich in der räumlichen Orientierung und Flexibilität unterscheiden, waren nur gering. Dies lässt vermuten, dass die verbindende Einheit in dimeren Liganden bezüglich der Adaptierung von hoch affinen Bindungsmodi am Rezeptor eine weniger wichtige Rolle spielt. Da einige der photochromen Peptide einen schwächeren Partialagonismus als das Musterpeptid aufwiesen, könnten die vorliegenden Ergebnisse bei der Entwicklung von Y4R Antagonisten helfen.
Die Synthese und biologische Untersuchung von kovalent bindenden photochromen GPCR- Liganden für die Einzelmolekülspektroskopie ist in Kapitel 3 dargestellt. Für Untersuchungen bezüglich kovalent gebundenen Photoschaltern wurden der ß2-adrenerge Rezeptor (ß2-AR) sowie der µ-Opioid-Rezeptor (µOR) betrachtet. Als hoch potente Agonisten für ß2-AR wurde BI-167107, für µOR Fentanyl verwendet. In beide Liganden wurden Azopyrazole eingebaut und kovalente Ankergruppen angefügt. Das Azopyrazol stellt die photochrome funktionale Einheit zwischen dem Pharmakophor und der Ankerposition dar. Die Änderung der Geometrie des kovalent gebundenen Liganden sollte die Bindung und Aktivierung beeinflussen. Es wurden verschiedene Synthesewege der pharmakologischen Kopfgruppe und der photochromen Einheit mit einer kovalenten Struktur, wie einem Disulfid oder einem Maleimid, entwickelt. Als entscheidender und letzter Schritt der Synthese der ß2-AR-Liganden wurde eine reduktive Aminierung durchgeführt, welche den kovalent bindenden Photoschalter mit der pharmakologischen Kopfgruppe verbindet. Die µOR-Liganden wurden mit einer Disulfid-Schutzgruppe oder durch post-Funktionalisierung eines Azopyrazol-Fentanylazides synthetisiert, wobei eine Maleimid- und N-Hydroxysuccinimidester-Funktion mittels Click-Reaktion installiert wurde. Die Untersuchung der photophysikalischen Eigenschaften der photochromen Liganden ergab eine sehr gute Ermüdungsresistenz und große thermische Halbwertszeiten der Azopyrazole. Erste biologische Untersuchungen zeigten hohe Bindungsaffinitäten für beide kovalente ß2-AR-bzw. µOR-Liganden am jeweiligen Wildtyp-Rezeptor und deutlich höhere Affinitäten an den verwendeten Mutanten der Rezeptoren. Hohe intrinsische Aktivitäten zeigten die synthetisierten Liganden in Experimenten mit ß-Arrestin-Assays (für ß2-AR) bzw. G-Protein-Aktivierung (für µOR). Letztendlich waren die Unterschiede in der Wirkung und Bindung zwischen den jeweiligen Photoisomeren nur gering. Da diese ersten Untersuchungen noch nicht die kovalente Bindung der Liganden berücksichtigten, sollten weitere Untersuchungen zur irreversiblen Bindung und der damit verbundenen Auswirkungen auf die Funktionalität durchgeführt werden, um ein besseres Verständnis der kovalenten Natur der Liganden zu bekommen.
Translation of the abstract (English)
This thesis focuses on the synthesis, photophysical characterization and application of photochromic G-protein receptor ligands. In Chapter 1 the incorporation of the well-investigated class of photochromic dithienylethenes (DTEs) and fulgides into known dopamine receptor ligands like 1,4-disubstituted aromatic and hydroxybenzoxazinone piperazines as well as aminoindanes is described. Subtype ...
Translation of the abstract (English)
This thesis focuses on the synthesis, photophysical characterization and application of photochromic G-protein receptor ligands.
In Chapter 1 the incorporation of the well-investigated class of photochromic dithienylethenes (DTEs) and fulgides into known dopamine receptor ligands like 1,4-disubstituted aromatic and hydroxybenzoxazinone piperazines as well as aminoindanes is described. Subtype and functional selective photochromic ligands were obtained and characterized by NMR and UV-VIS spectroscopic measurements. The photophysical properties of the DTE based dopamine ligands revealed a high fatigue resistance for the diarylmaleimides in DMSO, but the ringclosure could not be accomplished in aqueous solutions due to a known twisted intramolecular charge transfer (TICT). Several cyclopentene-DTEs showed high PSS, but a fast degradation by forming an irreversible byproduct. Focusing on the fulgides, high photostationary states and switching in polar solvents were possible. Fulgimides, containing the isopropyl group, showed only isomerization between the open E-form and the closed C-form. At a concentration of 1 nM, an open isomer of a cyclopentene-DTE derivative showed a more than 10-fold higher activation of D2S, a pharmacologically important G protein-coupled receptor, than its photochromic closed congener. Interestingly, a indolyl fulgimide-based pair (open/closed) could be discovered as an alternative photoswitch with inverse activation properties exhibiting four-fold higher activity in the closed state. Further studies on the optimization of GPCR-regulating photoswitches and biological investigations including reversible, light-induced control of photochromic ligands when bound to the receptor have to be done.
Chapter 2 deals with photochromic peptidic NPY Y4 receptor ligands. The neuropeptide Y (NPY) Y4 receptor is a G protein coupled receptor, which is targeted by pancreatic polypeptide, a homologue of NPY. Selective Y4R agonists were suggested as potential therapeutics for the treatment of obesity. Highly potent dimeric peptidic Y4R agonists, constituted of two pentapeptide moieties connected through an aliphatic linker, represent an interesting class of Y4R ligands. Based on this compound class, photoresponsive Y4R ligands, containing an azobenzene, azopyrazole, diethienylethene or a fulgimide chromophore were prepared to explore structural requirements of such Y4R agonists on Y4R binding. The synthesized Y4R ligands, containing a non-aliphatic rigid photochromic linker, switch reversible in aqueous buffer and exhibit high Y4R affinity throughout. This demonstrated that the replacement of the highly flexible aliphatic linker by a considerably less flexible photochromic linker was well tolerated with respect to Y4R binding. Differences in Y4R affinity and activity between the individual photoisomers (varying in spatial orientation and flexibility) were marginal. This suggests that the linking element in the dimeric ligands is less critical for the adaptation of high-affinity binding modes at the receptor. As some compounds proved to be weaker partial agonists than the model dimeric pentapeptide, this study might support the development of Y4R antagonists.
The synthesis and biological evaluation of covalent binding photochromic GPCR ligands for single molecule spectroscopy was is reported in chapter 3. The ß2-adrenergic receptor (ß2-AR) and the µ-opioid receptor (µOR) were choosen for investigations towards covalently bound photochromic ligands. Azopyrazoles, comprising an covalent tether, were embedded in the structures of the highly potent ß2-AR agonist BI-167107 and into the µOR-agonist fentanyl to obtain photochromic covalent ligands. The azopyrazole acts as the photochromic functional linker between the pharmacophore and the tethering position. Geometric changes should effect binding or receptor activation when toggling between the two photoisomers. A parallel investigation of different synthetic routes to synthesize the pharmacophoric moiety and the covalent groups, including a disulfide or a maleimide as the tethering group, was done. The crucial step for the ß2-AR ligands was accomplished in a reductive amination reaction connecting the photoresponsive tether and the pharmacophoric moiety as the final step. The µOR-ligands were synthesized with a disulfide protection group for the disulfide derivative or via a post functionalization of an azopyrazole-fentanyl azide, installing a maleimide- or a NHS ester-tethering group in a click-reaction. The photochemical characterizations of the photochromic ligands revealed high fatigue resistance and high thermal half-lives for the azopyrazoles. Initial biological investigations showed good binding affinities for both the covalent ß2-AR and µOR ligands towards the wild type receptor and much higher affinities for their corresponding mutant receptors. Functional studies on ß-arrestin recruitment for the ß2-AR and G-protein signaling for the µOR showed high intrinsic activities for the synthesized ligands. Finally, the differences in efficacy and binding between the E- and Z-isomers were only marginal. As the initial studies did not consider the covalent binding, further investigations would be to study irreversible binding and functional assays, to get more insight into the covalent nature of the ligands.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 18:30
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